膜下丘脑腹内侧神经元的电位染料成像从成年小鼠为研究葡萄糖传感
Summary
从成年鼠龄的单神经元的活性可以通过从特定脑区域的神经元解离，并使用荧光膜电位染料成像进行研究。通过测试响应变化的葡萄糖，这种技术可以用来研究成年腹内侧下丘脑神经元的葡萄糖敏感性。
Abstract
往往是由于随着结缔组织相关的技术难题进行神经元活动的研究利用老鼠不到2个月的婴儿神经元和下降随着年龄的增长出现的神经元生存力。在这里，我们描述了一种方法从成年小鼠岁健康丘脑神经元的解离。从成人 – 老年小鼠的神经元学习能力允许使用的疾病模型，体现在以后的年龄和可能更准确发育的某些研究。分离神经元的荧光成像可以用来研究神经元群体的活动，而不是使用电来研究单个神经元。当研究一种异构神经元群中的所需的神经元类型是罕见的，如用于下丘脑葡萄糖感受神经元，这是特别有用的。我们利用成人腹内侧下丘脑神经元的膜电位染料成像技术来研究他们的反应，茶民营企业在胞外葡萄糖。葡萄糖传感神经元被认为在能量平衡的中枢调节中发挥作用。研究葡萄糖传感成年啮齿类动物的能力，是因为涉及到不正常的能量平衡（ 例如 ，肥胖），随着年龄的增长疾病的优势是特别有用的。
Introduction
大脑通过神经内分泌和自主神经系统调节能量平衡。腹内侧下丘脑（VMH），由腹内侧核（VMN）和弓状核（ARC）的，是对能量平衡的中枢调节的重要。专门的葡萄糖传感神经元，在VMH内，连接神经元的活动和周边葡萄糖稳 态1。有两种类型的葡萄糖传感神经元;葡萄糖激发（GE）的神经元的增加，而葡萄糖抑制（GI）的神经元活动减少细胞外葡萄糖增加。 VMH葡萄糖感受神经元使用电或钙/膜电位敏感染料成像一般研究。
电生理膜片钳技术被认为是在体外神经元活动的研究的黄金标准。在该技术中，玻璃微电极通过高电阻连接到细胞膜（GΩ）封。膜片钳电极允许在单个神经元动作电位的频率（电流钳）或离子电导（电压钳）实时记录改变。而膜片钳技术提供了关于修改某些离子通道电导的详细信息，一个主要的缺点是只有一个神经元可以在同一时间观测到。这大约需要30-45分钟的记录来验证，一个是记录从葡萄糖传感神经元甚至开始一个具体的实验治疗。此外，GI和GE神经元组成<总VMH神经元群的20％。除了这种问题是缺乏对这些神经元的识别细胞标记的，在许多情况下，。因此，很清楚的是，尽管提供了宝贵的电信息的其它技术不能，膜片钳分析是费力，费时且产量低。
采用分离VMH神经元的荧光成像允许对胡的研究神经元的同时ndreds。钙敏感的染料可以被用于测量细胞内游离钙的变化，从而间接的关联，改变神经细胞的活动。膜电位敏感的染料被用于监控膜电位的变化。测量细胞膜电位是神经元活性相比的变化，细胞内钙水平的更直接的指标。此外，膜电位染料（MPD）成像检测潜在的膜电位变化较小，其中动作电位发放不改变，细胞内钙水平可能不会改变。这两种荧光成像技术已被用于研究VMH葡萄糖传感神经元从幼年小鼠2-7。虽然结果比那些与膜片钳电获得的不太详细，成像实验的实力，他们同时评估一个人口众多的细胞不可避免地包括一个显著的葡萄糖传感神经元的。 MPD成像我S对于研究胃肠神经元这是更均匀地分布在整个VMH本地化特别有用，从而提供足够的人口中分离VMH（〜15％GI）的研究。与此相反，而GE神经元密集地定位于腹外-VMN和ARC和VMN之间细胞贫穷地区，但并不代表一个显著数目的VMH内神经元的（<1％GE）。此外，通过研究分离出神经元，星形胶质细胞和突触前效应被消除。这可能是因为生理连接和过程都将丢失在研究一阶神经元的影响的优点，还有一个缺点。
在这两个膜片钳电生理和MPD /钙染料成像的一个限制因素是需要使用年轻的动物（ 例如 ，小鼠或大鼠<8周龄）。这主要是由于在发生随着年龄减少神经元生存力的组合增加结缔组织。在脑切片电螺柱IES，增加的结缔组织使之更难以以可视化的神经元。增加结缔组织也使得它更难分解大量健康的神经细胞的成像研究。此外，从年轻的动物的神经元或者膜片钳记录或在成像过程中存活时间更长。然而，使用年轻小鼠可以是一个重大的限制。神经元的活动和/或反应性神经递质或循环的营养物质变化与年龄。例如，由于能量平衡是紧密联系在一起的生殖状态，下丘脑神经元调节能量平衡可能在前期与postpubescent的动物有不同的反应。此外，许多疾病需要长期治疗或不表现，直到成年。这类疾病的最好的例子是饮食或肥胖2型糖尿病。由于葡萄糖传感神经元被认为在这些疾病中发挥作用，我们开发了一种方法，成功地培养健康成人VMH神经元用于MPD成像EXPeriments。
Protocol
Representative Results
Discussion
关键是能够研究神经元的活动从成年小鼠是健康的游离神经元的能力。从成年小鼠的下丘脑神经元的解离更难以在协议几个关键步骤相比，从幼年小鼠的神经元。我们已在许多方面克服了这个问题。制作厚500μm的脑片最大限度地减少机械损伤的神经元相比，用于从年轻小鼠脑组织通常的250-350微米的切片。然而，较厚的切片需要更加重视心脏灌注和脑组织的木瓜蛋白酶消化。如果血液被认为是对脑…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
美国国立卫生研究院R01 DK55619，美国国立卫生研究院R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
Riferimenti
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?. Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
- Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
- Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
- Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
- Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
- Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).
- Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
- Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).
