Membran Yetişkin farelerin ventromedial Hipotalamus Nöronlar Potansiyel Boya Görüntüleme Glikoz Algılama Çalışması için
Summary
Yetişkin-yaşlı farelerin tek nöronların aktivitesi belirli beyin bölgelerinde nöronları dissociating ve floresan membran potansiyeli boya görüntüleme kullanılarak incelenebilir. Glikoz değişikliklere test yanıtlar olarak, bu teknik, yetişkin ventromedial hipotalamus nöronları glikoz duyarlılığını belirlemek için kullanılabilir.
Abstract
Nöronal aktivite çalışmaları nedeniyle sık sık artan bağ dokusu ile ilgili teknik zorluklar kemirgenler yaş en az 2 ay nöronları kullanılarak gerçekleştirildi ve yaş ile oluşan nöronal canlılığı azalmıştır. Burada, yetişkin yaşlı farelerin sağlıklı hipotalamik nöronların ayrışma için bir metodoloji tarif eder. Yetişkin-yaşlı farelerin nöronların çalışma yeteneği daha geç bir yaşta tezahür ve bazı çalışmalar için daha fazla gelişimsel doğru olabilir hastalık modellerinin kullanımına izin verir. Tek bir nöron çalışma elektrofizyoloji kullanarak karşıt olarak ayrışmış nöron Floresan Görüntüleme, nöronların nüfusu aktivitesini incelemek için kullanılabilir. Istenen nöronal tipi, hipotalamik glikoz algılama nöronlar için nadir olan bir heterojen popülasyonu nöronal okuyan bu özellikle yararlıdır. Biz cha onların yanıtları incelemek için yetişkin ventromedial hipotalamik nöronların membran potansiyeli boya görüntüleme kullanılmaktadırhücre dışı glükoz nges. Glikoz algılama nöronlar enerji dengesi düzenlenmesinde merkezi bir rol oynadığına inanılmaktadır. Yetişkin kemirgenler glikoz algılamayı çalışma yeteneği işlevsiz enerji dengesi (örn.. Obezite) yaşla birlikte artış ile ilişkili hastalıkların baskın beri özellikle yararlıdır.
Introduction
Beyin nöroendokrin ve otonom sinir sistemleri ile enerji homeostazisini düzenler. Ventromedial hypothalamus (VMH), ventromedial çekirdeği (VMN) ve kavisli çekirdek (ARC) oluşan, enerji homeostazının düzenlenmesinde merkezi için önemlidir. İhtisas glikoz algılama nöronlar, VMH içinde, nöron aktivitesi ve periferik glukoz homeostazını 1. bağlantı. Glikoz heyecanlı (GE) glikoz (GI) nöronlar dışı glikoz arttıkça onların aktivitesini azaltmak inhibe ederken nöronlar artırmak; nöronların algılama glikoz iki türü vardır. VMH glukoz algılama nöronlar genellikle elektrofizyoloji veya kalsiyum / zar potansiyeli duyarlı boya görüntüleme kullanılarak incelenmiştir.
Elektrofizyolojik yama kenetleme tekniği ex vivo nöronal aktivitenin çalışmaya altın standart olarak kabul edilir. Bu teknikte, bir cam mikropipet elektrot yüksek direnç üzerinden hücre membranına bağlı olduğu(GΩ) mühür. Yama kelepçe elektrotlar aksiyon potansiyeli frekansı (akım kelepçe) veya iyon iletkenlik (gerilim kelepçe) gerçek zamanlı kayıt, tek bir nöronun içinde değişir sağlar. Yama kenetleme tekniği spesifik bir iyon kanal iletkenliklerini değişiklikler ile ilgili ayrıntılı bilgi sağlar birlikte, önemli bir dezavantajı, sadece bir nöron, bir süre gözlendi olmasıdır. Hatta, belirli bir deneysel tedavi başlamadan önce bir glikoz algılama nöron o bir kayıt olduğunu doğrulamak için kayıt yaklaşık 30-45 dakika sürer. Ayrıca, GI ve GE nöronlar <toplam VMH nöronal nüfusun% 20'sini oluşturmaktadır. Bu sorunu Bileşik bu nöronlar için tanımlayıcı bir hücre işaretleyici birçok durumda eksikliği vardır. Böylece, çok açıktır ki, diğer teknikler, yama kelepçe analiz zahmetli değil ki değerli elektrikli bilgiler, zaman alıcı ve düşük verim sağlayan rağmen.
Ayrışmış VMH nöronların floresan görüntülemenin hu çalışma sağlareş zamanlı olarak nöronların ndreds. Kalsiyum duyarlı boyalar dolaylı olarak nöronal aktivitenin değişikliklere ilişkili hücre içi kalsiyum değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Membran potansiyeli duyarlı boyalar zar potansiyel değişiklikleri izlemek için kullanılır. Hücre membran potansiyelinin ölçülmesi, hücre içi kalsiyum seviyelerinde değişiklik ile karşılaştırıldığında nöronal aktivitenin daha doğrudan bir endeksidir. Ayrıca, membran potansiyeli boya (MPD) görüntüleme potansiyel aksiyon potansiyeli ateşleme değişmiş değildir ve hücre içi kalsiyum düzeyleri değişiklik olmayabilir membran potansiyeli küçük değişiklikleri algılar. Bu flüoresan görüntüleme teknikleri Hem genç farelerde 2-7 dan VMH glikoz algılama nöronlar incelemek için kullanılmıştır. Sonuçlar yama klempi elektrofizyoloji ile elde edilenden daha az ayrıntılı olarak olsa da, görüntüleme deneylerin kuvveti, aynı anda, kaçınılmaz olarak glikoz algılama nöronların önemli bir sayısını içerir hücrelerin geniş bir popülasyonu değerlendirmek olmasıdır. MPD görüntüleme idaha düzgün olarak VMH boyunca lokalize GI nöronlar çalışmak için özellikle kullanışlıdır, böylece ayrışmış VMH (~ 15% GI) olarak çalışmak üzere yeterli bir popülasyonu sağlanır. GE nöronlar yoğun ventrolateral-VMN ve ARC ve VMN arasında hücre zayıf bölgede lokalize ise aksine, bunlar VMH içinde nöronların önemli sayıda (<% 1 GE) temsil etmemektedir. Ayrıca, izole nöronların inceleyerek, Astrositik ve presinaptik etkileri ortadan kalkar. Fizyolojik bağlantılar ve işlemler kaybolur beri bu ilk sipariş nöron etkilerini inceleyerek bir avantaj, hem de dezavantaj olabilir.
Yama kelepçe elektrofizyoloji ve MPD / kalsiyum boya görüntülemede hem de sınırlayıcı faktör, daha küçük hayvanların (örneğin,. Fareler veya sıçanlar <yaşı 8 hafta) kullanmak için ihtiyaç vardır. Bunun nedeni, yaşla birlikte ortaya çıkar azalma nöronal canlılığı ile bir arada artan bağ dokusu için ağırlıklı olarak. Beyin dilim elektrofizyoloji saplamaler, artan bağlayıcı doku daha zor nöronlar görselleştirmek için yapar. Artan bağ dokusu da zor görüntüleme çalışmaları için sağlıklı nöron çok sayıda ayırmak için yapar. Ayrıca, genç hayvanların nöronlar yama kelepçe kayıt veya görüntüleme sırasında da uzun süre hayatta. Ancak genç farelerin kullanımı, önemli bir sınırlama olabilir. Nöronal etkinliği ve / veya nörotransmiterler ya da dolaşım besin tepkiler yaş ile değiştirin. Enerji dengesi yakından üreme durumuna bağlı olduğundan Örneğin, enerji dengesini düzenleyen hipotalamik nöronlar postpubescent hayvanların öncesi vs farklı yanıt verebilir. Ayrıca, birçok hastalıkların uzun süreli tedavi gerektiren ya da yetişkinliğe kadar tezahür yok. Bu tür hastalıkların Başbakanı örnekleri beslenme obezite ve Tip 2 Diabetes Mellitus vardır. Glikoz algılama nöronlar, bu hastalıklarda bir rol oynadığına inanılmaktadır beri başarıyla MPD görüntüleme exp kullanılmak için sağlıklı yetişkin VMH nöronların kültür için bir yöntem geliştirdieriments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yetişkin farelerden alınan nöronların aktivitesini incelemek mümkün olmanın anahtarı sağlıklı nöronlar ayırmak için yeteneğidir. Yetişkin farelerden hipotalamus nöronları ayrışması, çocuk farelerden nöronların kıyasla protokolde çeşitli önemli adımlardan daha zordur. Biz, bir dizi yolla, bu sorunun üstesinden gelmiştir. 500 um kalınlığında Beyin dilimleri yapmak küçük farelerden alınan beyin dokusu için kullanılan olağan 250-350 um dilimleri ile karşılaştırıldığında nör…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
Riferimenti
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?. Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
- Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
- Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
- Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
- Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
- Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).
- Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
- Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).
