Membrana Potencial Dye imagem de Ventromedial Hipotálamo Neurônios de camundongos adultos para estudar Glucose Sensing
Summary
A atividade de neurônios individuais de ratos em idade adulta pode ser estudado por dissociar os neurônios de regiões específicas do cérebro e usando membrana fluorescente potencial de imagem corante. Por testes de respostas a alterações nos níveis de glucose, esta técnica pode ser utilizada para estudar a sensibilidade à glicose dos neurónios hipotalâmicos ventromediais adultos.
Abstract
Estudos sobre a atividade neuronal são frequentemente realizadas utilizando neurônios de roedores com menos de 2 meses de idade, devido às dificuldades técnicas associadas com o aumento do tecido conjuntivo e diminuição da viabilidade neuronal que ocorrem com a idade. Aqui, descrevemos uma metodologia para a dissociação de neurônios do hipotálamo de ratos saudáveis em idade adulta. A capacidade para estudar os neurónios de ratos adultos em idade permite a utilização de modelos de doenças que se manifestam numa idade mais avançada e pode ser mais preciso para a developmentally certos estudos. Imagens de fluorescência de neurónios dissociados pode ser utilizado para estudar a actividade de uma população de neurónios, em oposição ao uso de electrofisiologia para estudar um único neurónio. Isso é particularmente útil quando se estuda uma população neuronal heterogêneo no qual o tipo neuronal desejado é raro, como para glicose sentindo neurônios do hipotálamo. Utilizamos membrana potencial de imagem corante de neurônios do hipotálamo ventromedial adultos para estudar as suas respostas a chaNGES na glucose extracelular. Neurônios sensores de glicose são acreditados para jogar um papel na regulação central do equilíbrio energético. A capacidade para estudar a detecção de glicose em roedores adultos é particularmente útil uma vez que a predominância de doenças relacionadas com o balanço de energia disfuncional (por exemplo. Obesidade) aumentar com a idade.
Introduction
O cérebro regula a homeostase energética através da neuroendócrino e sistema nervoso autônomo. O hipotálamo ventromedial (VMH), constituída pelo núcleo ventromedial (VMN) e o núcleo arqueado (ARC), é importante para a central de regulação da homeostase da energia. Neurônios sensores de glicose Especializadas, no VMH, vincular a atividade neuronal e homeostase da glicose periférica 1. Existem dois tipos de sensores de glicose neurônios; glicose animado (GE) neurônios aumentar enquanto a glicose inibida (GI) neurônios diminuir a sua actividade com o aumento da glicose extracelular. Neurônios glicose VMH sensores geralmente são estudados utilizando eletrofisiologia ou cálcio / membrana potencial de imagem sensível corante.
A técnica de patch clamp eletrofisiológico é considerada o padrão-ouro no estudo da atividade neuronal ex vivo. Nesta técnica, um eléctrodo de micropipeta de vidro é ligado à membrana celular através de uma elevada resistência(GÊ) selo. Eletrodos patch clamp permitir a gravação em tempo real do potencial de ação freqüência (pinça de corrente) ou condutância de íons (braçadeira de tensão) muda dentro de um único neurônio. Embora a técnica de patch clamp fornece informações detalhadas sobre mudanças na condutância de canais iônicos específicos, uma grande desvantagem é que apenas um neurônio pode observar ao mesmo tempo. Demora cerca de 30-45 minutos de gravação para verificar que se está a gravação de um neurônio sensor de glicose antes mesmo de iniciar um tratamento experimental específico. Além disso, GI e GE neurônios compreendem <20% do total da população neuronal VMH. Para agravar este problema é a falta, em muitos casos, de um marcador celular de identificação para esses neurônios. Assim, é evidente que apesar de fornecer informação eléctrica valiosa que outras técnicas não é possível, a análise de fixação de membranas é trabalhoso, demorado e baixo rendimento.
A utilização de imagens de fluorescência de neurónios dissociados VMH permite o estudo de hundreds de neurônios simultaneamente. Corantes sensíveis de cálcio pode ser utilizado para medir alterações de cálcio intracelular, que indirectamente se correlacionam com alterações na actividade neuronal. Corantes sensíveis potenciais de membrana são utilizados para monitorar mudanças potenciais de membrana. Medir o potencial de membrana celular é um indicador mais directa da actividade neuronal em comparação com alterações nos níveis de cálcio intracelular. Além disso, a membrana potencial corante (MPD) imagens potencialmente detectar pequenas mudanças no potencial da membrana onde a ação potencial de disparo não é alterada e os níveis de cálcio intracelular pode não mudar. Ambas as técnicas de imagiologia de fluorescência foram utilizados para estudar VMH neurónios sensores de glucose de ratinhos jovens 2-7. Embora os resultados são menos detalhadas do que as obtidas com patch clamp eletrofisiologia, a força de experimentos com imagens é que eles avaliam simultaneamente uma grande população de células que, inevitavelmente, incluem um número significativo de neurônios sensores de glicose. MPD i imagemé particularmente útil para estudar os neurónios GI que são mais uniformemente localizada ao longo de todo o VMH; proporcionando assim uma população adequada para estudar o VMH dissociado (~ 15% GI). Por outro lado, enquanto os neurônios da GE são densamente localizada no ventrolateral-VMN e celular pobre região entre o ARC e VMN, eles não representam um número significativo de neurônios dentro do VMH (<1% GE). Além disso, através do estudo de neurônios isolados, astrocitária e efeitos pré-sinápticos são eliminados. Isto pode ser uma vantagem em estudar os efeitos de primeira ordem de neurónios, bem como uma desvantagem uma vez que as ligações e os processos fisiológicos estão perdidos.
Um factor limitante, tanto Electrofisiologia de fixação de membranas e MPD / cálcio corante de imagem é a necessidade de utilizar animais mais novos (por exemplo, ratos ou ratazanas. <8 semanas de idade). Isto é, predominantemente, devido a um aumento do tecido conjuntivo, em combinação com a diminuição da viabilidade neuronal que ocorre com a idade. No cérebro-slice eletrofisiologia do parafuso prisioneiros, o aumento do tecido conjuntivo faz com que seja mais difícil visualizar os neurônios. O aumento do tecido conjuntivo também torna mais difícil dissociar um grande número de neurônios saudáveis para estudos de imagem. Além disso, os neurônios dos animais mais jovens sobrevivem por mais tempo durante o registo patch clamp ou imagem. No entanto, o uso de ratos jovens pode ser uma grande limitação. Actividade e / ou uma resposta a neurotransmissores ou nutrientes que circulam neuronal muda com a idade. Por exemplo, uma vez que o balanço energético está intimamente ligada ao estado reprodutivo, os neurônios do hipotálamo que regulam o balanço energético podem responder de forma diferente em pré-vs animais pós-púberes. Além disso, muitas doenças necessitam de um tratamento a longo prazo ou não se manifestar até a idade adulta. Os principais exemplos de tais doenças são a obesidade dietética ou Diabetes Mellitus Tipo 2. Desde neurônios sensores de glicose são acreditados para jogar um papel nestas doenças, desenvolvemos uma metodologia para cultivar com sucesso adultos VMH neurônios saudáveis para uso em exp imagem MPDeriments.
Protocol
Representative Results
Discussion
A chave para ser capaz de estudar a atividade dos neurônios de camundongos adultos é a capacidade de dissociar os neurônios saudáveis. A dissociação dos neurônios do hipotálamo de camundongos adultos é mais difícil em vários passos-chave no protocolo em comparação com neurônios de ratos juvenis. Temos superar este problema de várias formas. Fazendo grossas fatias de 500 mm do cérebro minimiza danos mecânicos aos neurônios, em comparação com os habituais 250-350 mM fatias utilizados para o tecido cere…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
Riferimenti
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