Membranpotential Dye avbildning av ventromediala Hypothalamus nervceller från vuxna möss för att studera Glucose Sensing
Summary
Aktiviteten av enstaka nervceller från vuxna-äldre möss kan studeras genom att ta avstånd nervceller från specifika delar av hjärnan och med hjälp av fluorescerande membranpotential färg bildbehandling. Genom att testa reaktioner på förändringar i glukos, kan denna teknik användas för att studera glukoskänslighet vuxna ventromediala hypotalamus nervceller.
Abstract
Studier av neuronal aktivitet utförs ofta med hjälp av nervceller från gnagare mindre än 2 månaders ålder på grund av de tekniska svårigheter som är förknippade med ökad bindväv och minskad neuronal livsduglighet som uppstår med åldern. Här beskriver vi en metod för dissociation av friska hypotalamus nervceller från vuxna-äldre möss. Möjligheten att studera nervceller från vuxenåldern möss tillåter användning av sjukdomsmodeller som manifesterar vid en senare ålder och kan vara mer utvecklingsmässigt korrekta för vissa studier. Fluorescens avbildning av dissocierade nervceller kan användas för att studera aktiviteten av en population av nervceller, jämfört med att elektrofysiologi för att studera en enda neuron. Detta är särskilt användbart när man studerar en heterogen neuronal population i vilken den önskade neuronal typ är sällsynt såsom hypotalamiska glukos avkänning neurons. Vi utnyttjade membranpotential färgämne avbildning av vuxna ventromediala hypotalamus nervceller för att studera deras svar till changes i extracellulär glukos. Glukos avkännande neuroner tros spela en roll i centrala regleringen av energibalansen. Möjligheten att studera glukosanalys hos vuxna gnagare är särskilt användbart eftersom övervikt av sjukdomar relaterade till dysfunktionella energibalans (t ex. Övervikt) ökar med åldern.
Introduction
Hjärnan reglerar energi homeostas genom neuroendokrina och autonoma nervsystemet. Det ventromediala hypotalamus (VMH), som består av den ventromediala kärnan (VMN) och den bågformiga kärnan (ARC), är viktigt för att den centrala regleringen av energi homeostas. Specialiserade glukos avkänning nervceller, inom VMH, länka neuronal aktivitet och perifer glukoshomeostas 1. Det finns två typer av glukos avkänning nervceller, glukos upphetsad (GE) nervceller öka medan glukos hämmas (GI) nervceller minskar sin verksamhet som extracellulära glukos ökar. VMH glukos avkänning nervceller i allmänhet studeras med hjälp av elektrofysiologi eller kalcium / membranpotential känsligt färgämne avbildning.
Den elektrofysiologiska patch clamp-tekniken anses vara den gyllene standarden i studien av ex vivo nervaktivitet. Vid denna teknik används en glasmikropipett elektrod fäst till cellmembranet via en hög resistans(GΩ) tätning. Patch clamp elektroder tillåter realtid registrera aktionspotential frekvens (strömtång) eller jon konduktans (spänning klämma) förändras inom en enskild neuron. Medan patch clamp teknik ger detaljerad information om förändringar i specifika jonkanal konduktanser, är en stor nackdel att endast en neuron kan observeras i taget. Det tar ca 30-45 min för inspelning för att kontrollera att man spelar in från en glukossensor neuron innan ens börjar en viss experimentell behandling. Dessutom, GI och GE nervceller omfattar <20% av den totala VMH neuronala befolkningen. Compounding denna fråga är bristen, i många fall av en identifierande cellulär markör för dessa nervceller. Således är det uppenbart att trots att ge värdefull elektrisk information att andra tekniker kan inte, är patch clamp-analys mödosamt, tidskrävande och lågt utbyte.
Användningen av fluorescensavbildning av dissocierade VMH neurons möjliggör studiet av hundreds av nervceller samtidigt. Kalciums känsliga färgämnen kan användas för att mäta intracellulära kalciumförändringar, som indirekt korrelerar till förändringar i neuronal aktivitet. Membranpotential känsliga färgämnen används för att övervaka membran potentiella förändringar. Mätning cellulär membranpotential är en mer direkt index av neuronal aktivitet jämfört med förändringar i intracellulära kalciumnivåer. Dessutom upptäcker membranpotential färgämne (MPD) imaging potentiellt mindre förändringar i membranpotential där aktionspotential bränning inte ändras och intracellulära kalciumnivåer kan inte ändras. Båda dessa fluorescens avbildningstekniker har använts för att studera VMH glukos avkänning nervceller från unga möss 2-7. Även om resultaten är mindre detaljerade än de som erhållits med patch clamp elektrofysiologi, är styrkan i imaging experiment som de samtidigt utvärdera en stor population av celler som oundvikligen innefattar ett betydande antal glukossensor nervceller. MPD avbildning iär särskilt användbart för att studera GI nervceller som är mer enhetligt lokaliserad i hela VMH, vilket ger en lämplig population att studera i den dissocierade VMH (~ 15% GI). Däremot, medan GE nervceller är tätt lokaliserade till ventrolaterala-VMN och cell fattig region mellan ARC och VMN, att de inte utgör ett betydande antal nervceller inom VMH (<1% GE). Dessutom, genom att studera isolerade nervceller, astrocytic och presynaptiska effekter elimineras. Detta kan vara en fördel, i att studera första ordningens neuron effekter, såväl som en nackdel eftersom fysiologiska anslutningar och processer går förlorade.
En begränsande faktor i både patch clamp elektrofysiologi och MPD / kalcium färgämne avbildning är behovet av att använda yngre djur (t ex. Möss eller råttor <8 veckors ålder). Detta är främst på grund av ökad bindväv i kombination med minskad neuronal viabilitet som sker med åldern. I hjärnan-skiva elektrofysiologi studies, gör ökad bindväv det svårare att visualisera nervceller. Ökad bindväv gör det också svårare att särskilja ett stort antal friska nervceller för imaging studier. Dessutom nervceller från yngre djur överlever längre under någon patch clamp inspelning eller bildbehandling. Emellertid kan användning av unga möss är en stor begränsning. Neuronal aktivitet och / eller svar på signalsubstanser eller cirkulerande näringsämnen förändras med åldern. Till exempel, eftersom energibalansen är nära knuten till reproduktiv status, kan de hypotalamus nervceller som reglerar energibalansen reagerar olika i pre-vs postpubescent djur. Dessutom har många sjukdomar kräver långtidsbehandling eller inte uppenbart förrän i vuxen ålder. Utmärkta exempel på sådana sjukdomar är kost fetma eller typ 2 diabetes mellitus. Eftersom glukos avkänning nervceller tros spela en roll i dessa sjukdomar vi utvecklat en metodik för att framgångsrikt odla friska vuxna VMH nervceller för användning i MPD imaging experiments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nyckeln till att kunna studera aktiviteten i nervceller från vuxna möss är förmågan att skilja friska nervceller. Dissociation av hypotalamus nervceller från vuxna möss är svårare på flera viktiga steg i protokollet jämfört med nervceller från unga möss. Vi har övervunnit detta problem på ett antal olika sätt. Göra tjock 500 pm hjärnan skivor minimerar mekaniska skador på nervceller jämfört med de vanliga 250-350 ìm skivor som används för hjärnvävnad från yngre möss. Men tjockare skivor krä…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
Riferimenti
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?. Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
- Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
- Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
- Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
- Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
- Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).
- Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
- Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).
