Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

Summary

Las bacterias producen compuestos secretados que tienen el potencial de afectar a la fisiología de sus vecinos microbianos. Aquí se describe una pantalla de co-cultivo que permite la detección de este tipo de interespecies mediadas químicamente interacciones mediante la mezcla de los microbios del suelo con cepas reportero transcripcional fluorescentes de Bacillus subtilis en medios sólidos.

Abstract

En la naturaleza, rara vez existen bacterias en forma aislada, sino que están en vez rodeados por una gran variedad de otros microorganismos que alteran el medio ambiente local mediante la secreción de metabolitos. Estos metabolitos tienen el potencial de modular la fisiología y la diferenciación de sus vecinos microbianos y son factores importantes que puedan en el establecimiento y mantenimiento de las comunidades microbianas complejas. Hemos desarrollado una pantalla de cocultivo basado en la fluorescencia para identificar tales interacciones microbianas mediadas químicamente. La pantalla se combina una transcripción cepa fluorescente reportero con microbios ambientales en medios sólidos y permitiendo que las colonias crezcan en cocultivo. El reportero transcripcional fluorescente está diseñado de manera que la cepa bacteriana elegida emite fluorescencia cuando se está expresando un fenotipo particular de interés (es decir, la formación de biopelículas, la esporulación, la producción de factor de virulencia, etc.) El cribado se realiza en condiciones de crecimiento where este fenotipo no se expresa (y por lo tanto la cepa reportero es típicamente no fluorescente). Cuando un microbio ambiental segrega un metabolito que activa este fenotipo, que se difunde a través del agar y activa el constructo indicador fluorescente. Esto permite que el productor de metabolitos de inducción de microbio a detectar: ​​son las colonias no fluorescentes más proximales a las colonias fluorescentes. Por lo tanto, esta pantalla permite la identificación de los microbios ambientales que producen metabolitos difusibles que activan una respuesta fisiológica particular, en una cepa reportero. Esta publicación explica cómo: a) seleccionar las condiciones de selección adecuadas co-cultivo, b) preparará el reportero y microbios ambientales para la detección, c) realizar la pantalla de co-cultivo, d) aislar organismos putativo inducir, y e) confirmar su actividad en una pantalla secundaria. Hemos desarrollado este método para la detección de organismos del suelo que activan biopelícula matriz de producción en Bacillus subtilis </em>, sin embargo, también discutimos las consideraciones para la aplicación de este enfoque a otras bacterias genéticamente tratables.

Introduction

Estamos interesados ​​en la comprensión de cómo los metabolitos que las bacterias secretan afectan la fisiología y el desarrollo de los microbios vecinos. Muchos metabolitos se han caracterizado por sus efectos bioactivos sobre otros microbios. Dos ejemplos bien descritos incluyen antibióticos, que inhiben el crecimiento de otros microbios, y las moléculas de detección de quórum, que alteran la expresión génica global de otros microbios. Sin embargo, las bacterias producen muchos otros pequeños productos naturales de molécula que no tienen bioactividades conocidos ^1. Nuestra hipótesis es que las bacterias han evolucionado y conservado la capacidad de producir algunos de estos metabolitos, ya que les permite modular la fisiología celular de sus vecinos microbianas en las complejas comunidades microbianas dentro de la cual existen la mayoría de las bacterias.

Tipos de células de Bacillus subtilis

Nos hemos centrado nuestros estudios sobre las interacciones microbianas mediadas químicamente que involucran Bacilsubtilis lus. Esto no es sólo debido a su estatus como modelo la bacteria Gram-positivas y las herramientas genéticas resultantes disponibles para su manipulación, pero también por su capacidad de diferenciarse en tipos de células caracterizadas. Algunos ejemplos son las células que son: natación, que producen la matriz extracelular que se requiere para la formación de biopelículas robusta; competentes para tomar ADN del medio ambiente, y en esporulación, entre otros ^2. Cada uno de estos tipos de células expresa un regulón transcripcional característica que los hace fisiológicamente y / o físicamente distinto de sus hermanos genéticamente idénticos. Bajo muchas condiciones de crecimiento, múltiples tipos de células coexisten como diversas subpoblaciones dentro de una sola colonia de B. subtilis células ^3. Aunque muchas especies de bacterias pueden exhibir análoga tipo celular heterogeneidad, este fenómeno ha sido particularmente bien estudiado en B. subtilis.

En particular, los genes que son UPRegulated dentro de cada uno de ellos específico B. Se han identificado los tipos de células subtilis. La identificación de estos genes regulados positivamente es esencial para el trabajo que se describe aquí, porque muchos de estos fenotipos microbianas de interés son difíciles o imposibles de observar directamente. Por ejemplo, no se puede detectar visualmente un rasgo como la natación (1.5%) placas de agar sólido, a pesar de que una subpoblación de B. subtilis células producen flagelos en esas condiciones ^3. Otro ejemplo es la matriz-la producción de biopelículas. Producción de la matriz puede ser visualizado por morfología de las colonias (tal como resulta en colonias macroscópicamente arrugadas), pero sólo en cierta medio de crecimiento, y sólo después de varios días de crecimiento ^4. Sin embargo, sabiendo que son upregulated genes durante la diferenciación, podemos construir reporteros transcripcionales que actúan como marcadores para la diferenciación celular en estos tipos de células.

Reportero construcciones

Estos fluorescente treporteros ranscriptional consisten de los promotores de genes específicos de tipo celular de conducir la producción de un gen reportero, por ejemplo una proteína fluorescente. Los ejemplos incluyen P _HAG-YFP (para células natación), P _tapa-YFP (para células de la matriz de producción de biofilm), y P _SSPB-YFP (por esporulación de las células), donde P _x indica la región del promotor para el gen x. Estas construcciones indicadoras se integran en un locus neutro en el cromosoma (Figura 1 y ver más abajo) de manera que la regulación natural de la fenotipo se deja intacta. Sin embargo, ahora, cuando una célula expresa este fenotipo, sino que también expresa una proteína fluorescente. Esto proporciona una lectura de la activación de comportamiento fenotípico particular, puede visualizar fácilmente, lo que nos permite para detectar microbios que activan la respuesta fisiológica. Aunque tales reporteros son comúnmente utilizados en microbiología, que no se han aplicado ampliamente en pantallas a identifinteracciones metabólicas Y entre los microbios antes de este método fue descrito ^5.

Hay una serie de consideraciones importantes en el diseño y construcción de reportero cepas celulares específicos del tipo. Hemos utilizado los reporteros fluorescentes exclusivamente de la transcripción, aunque otros tipos de construcciones son ciertamente posibles. Desaconsejamos el uso de fusiones de traducción como marcadores para el tipo de célula diferenciación en nuestra pantalla, sin embargo, por dos razones: 1) el deseo de abandonar el tipo de células específicas proteína nativa no perturbada, y 2) el reconocimiento de que un difuso, de células- amplia de fluorescencia será más fácil de detectar que puntos lagrimales localizado dentro de las células (común con fusiones de traducción).

La selección de genes reportero

Después de tomar la decisión de usar la transcripción como un dispositivo de lectura, el gen reportero debe ser seleccionado (por ejemplo, LacZ, fluorescencia, o luciferasa). LacZ tiene la ventaja de necesitar menos especialzado equipos para detectar, pero hay una probabilidad mucho mayor de falsos positivos entre los microbios ambientales. En nuestras manos, el nivel de fondo de LAC ⁺ organismos entre los microbios del suelo era prohibitivo (>> 10% de los microbios del suelo eran azules (Lac ⁺⁾ en placas X-gal; datos no presentados). Es posible que mediante la valoración de la concentración de X-gal en el medio, esto puede ser optimizado para permitir el uso de un reportero de X-gal, aunque no se intentó esto. Luciferasa ofrece una alta sensibilidad de detección y es el reportero más ortogonal: no hay casi ninguna posibilidad de microbios ambientales ser inherentemente luminiscente. Sin embargo, encontramos que hace difícil identificar la instrumentación en nuestra institución que permitió la detección de luminiscencia a través de la totalidad de las placas de Petri, ya que la mayoría fueron diseñados para explorar regiones localizadas sólo en placas de múltiples pocillos. También puede haber complicaciones en la visualización de colonias luminiscentes de una manera que también permitió la física simultánea esolation de organismos que inducen. Durante el uso de los fiduciarios puede haber hecho esto posible, en lugar elegido para utilizar marcadores transcripcionales fluorescentes, que se ha comprobado que funcionan en B. subtilis, a condición de sensibilidad adecuada de detección y bajas tasas de falsos positivos entre los organismos del suelo, y les permite usar de la instrumentación fácilmente disponible tanto para la visualización y procedimientos de aislamiento.

Selección Fluoróforo

El fluoróforo específico seleccionado dependerá de sus especies bacterianas, el medio de cultivo de agar que está usando, y el filtro de fluorescencia especial establece que tiene disponible. Con nuestro instrumentación, se encontró que tanto la B. subtilis colonias ellos mismos y el agar que se cultivaron en exhibieron menos fluorescencia de fondo cuando se utilizaron YFP (proteína fluorescente de color amarillo) filtros, por lo que el reportero superior a GFP (proteína fluorescente verde) en nuestras manos. El uso de codones de proteínas fluorescentes estánfrecuencia optimizada para eucariotas, por lo que es importante seleccionar un fluoróforo o bien conocidos por la literatura para trabajar en sus especies de bacterias, o para probar de forma explícita el uso de un promotor constitutivo. Un gran número de las siempre cambiantes variantes de la proteína fluorescente están actualmente disponibles ^6, que se han revisado en varias fuentes ^7,8, algunas de las cuales prevé explícitamente orientación sobre la elección de una proteína fluorescente apropiado para su experimento ^9.

Selección del promotor

La selección de un promotor dependerá en gran medida del tipo de célula o fenotipo de interés. Para los organismos tales como B. subtilis, algunos genes indicadores específicos de tipo celular se han establecido en la literatura. Para otras cepas bacterianas, el examen de microarrays o datos de la transcripción será necesario para proporcionar información acerca de qué genes están muy upregulated bajo las condiciones en las que el tipo de célula de interés is manifestada. Un estudio reciente catalogado la transcripción de B. subtilis 104 bajo condiciones de crecimiento diferentes con suelo de baldosas microarrays ^10. Este documento proporciona información completa acerca de qué genes están altamente regulados por incremento en diferentes condiciones, que tiene un valor incalculable para los fenotipos menos bien caracterizados.

En lugar de la cartografía de las regiones precisas de promotor para cada gen de interés, por lo general simplemente usamos la secuencia de 200-500 pb aguas arriba del gen como el promotor. La duración exacta depende de la secuencia genómica contexto: las regiones más cortas se utilizan cuando es necesario para evitar la inclusión de las regiones de codificación de aguas arriba de la vecina marcos de lectura abierta.

Loci y la integración Neutro

¿Cómo mantener el reportero construir en su cepa bacteriana se convierte en la última pregunta en el diseño de una cepa reportero transcripcional fluorescente. En las bacterias, los genes de interés se mantienen con frecuenciaen plásmidos utilizando la selección de antibióticos. Sin embargo, puede que no sea posible utilizar antibióticos durante cocultivo sin matar los microbios ambientales. Si plásmidos se mantienen establemente en sus especies de bacterias, puede ser posible que aumenten sus bacterias que contiene un reportero plásmidos cargo en presencia de antibióticos para preparar su reportero en los controles, y luego eliminar los antibióticos durante la propia co-cultivo con la esperanza de que el plásmido se ser suficientemente mantenido para permitir la fluorescencia. Sin embargo, si los plásmidos se pierden fácilmente en su bacteria, o se pierden en condiciones de estrés, esto no será una opción viable. En muchos casos, la mejor solución será integrar el constructo indicador en el cromosoma bacteriano, que permite el mantenimiento estable del reportero, incluso en ausencia de selección. Para que la integración de no interrumpir la expresión normal o regulación de su gen de interés, se recomienda integrar en un sitio ectópico en el cromosoma que can actuar como un "locus neutro." En B. subtilis estos sitios de integración son los genes que – cuando muta – transmitir un fenotipo en ciertos medios mínimos (que permite a los integrantes pueden identificar sin selección de antibióticos), y sin embargo no alteran el crecimiento o las tasas de esporulación en rich media, e incluyen genes tales como amyE, lacA, thrC, pyrD, gltA, y sacA (transporte de la capacidad de utilizar almidón, β-galactósidos, treonina, uracilo, glutamato, y sacarosa, respectivamente) ^11-13.

Mientras que la integración en estos genes se han utilizado de forma fiable durante muchos años en B. subtilis (particularmente en amyE y lacA), un conocimiento similar, puede no estar disponible para los genes en otras especies bacterianas. El uso de los sitios de unión de fagos son grandes alternativas para los sitios de integración cromosómica neutros: muchas especies específicas de ^{14 a 16,} así como los sitios de integración generales, tales como el sitio de unión Tn7 (Tn7 att) tienenhan identificado y utilizado para las inserciones de genes en muchas especies bacterianas ^17,18.

Microbios ambientales

Utilizamos el suelo como fuente directa de microorganismos ambientales para nuestra pantalla de co-cultivo. El suelo contiene una gran diversidad de microbios, y muchos de estos organismos son rica fuente de productos naturales. Mediante el uso de suspensiones líquidas de suelos colocados directamente sobre las placas con nuestra cepa fluorescente reportero transcripcional (sin aislamiento previo de las bacterias del suelo), simplificamos en gran medida el enfoque experimental. El suelo o bien se puede utilizar inmediatamente después de la cosecha, o se congeló a -80 ° C para su uso futuro. El uso inmediato tiene la ventaja de que una mayor diversidad de microbios potencialmente se puede cultivar, incluidos los que no va a sobrevivir la congelación también. Tiene la desventaja de que se desconoce la concentración de los organismos del suelo cultivables partir de estas muestras, lo que aumenta el número de placas de pantalla que se debe utilizar. Deluso ayed tiene la ventaja de que las ufc / ml para cada fuente de suelo se pueden determinar de antemano, lo que permite un número optimizado de colonias que se cultiva en cada placa pantalla. Sin embargo, requiere que los organismos del suelo sean capaces de sobrevivir a la congelación.

Tenga en cuenta que la diversificación de la piscina inductor siendo examinada (es decir, las fuentes de suelo) parece ser más eficaz en la identificación de nuevas interacciones entre especies que el cribado en profundidad sobre el mismo suelo: una mayor diversidad filogenética se observó en los accesos identificados en nuestra pantalla de matriz de inducción como fuentes de suelos además se examinaron en lugar de detección de las mismas fuentes de suelos más a fondo (EA Shank y R. Kolter, Escuela de Medicina de Harvard, resultados no publicados).

Visión de conjunto

El enfoque que describimos aquí es sencillo en cuanto a sus requisitos técnicos. Se trata de: 1) la construcción de un reportero transcripcional fluorescente en B. subtilis o unaotras especies bacterianas de interés, 2) la identificación de condiciones bajo las cuales no se activa este reportero, 3) la preparación de partes alícuotas de esta cepa reportero y organismos que se proyectarán (en nuestro caso del suelo, pero otras fuentes podrían ser utilizados en su lugar), 4) la mezcla de estos dos conjuntos de microbios en medios sólidos, 5) identificar y aislar los organismos putativo inducir, y 6) confirmando que estos organismos en efecto, activan este fenotipo en una pantalla secundaria. Una vez identificados, estos organismos y sus metabolitos nos proporcionan herramientas químicas para modular el comportamiento bacteriano, para estudiar la fisiología bacteriana y las interacciones microbianas y actuar potencialmente como nuevos andamios para compuestos terapéuticos futuros.

Protocol

1. Seleccionar un gen informador y Construir un reportero fluorescente transcripcional Para B. subtilis: Consulte el artículo de Jove en referencia 19 para un protocolo que describe la construcción de marcadores transcripcionales fluorescentes en Bacillus subtilis. Para otras especies bacterianas: Identificar un gen que se regula positivamente durante la respuesta fisiológica de interés. Esto…

Representative Results

Se utilizó este pantalla para identificar los organismos del suelo secretoras de compuestos que alteran la fisiología de B. subtilis. Los resultados descritos aquí se centran en el tipo de célula-matriz de la producción de B. subtilis, que produce la proteína y de exopolisacáridos que se requieren para la formación de biopelículas robusta en esta bacteria. Seleccionamos el promotor del operón tapa-sipW-TASA para nuestra construcción informadora fluorescente (P tapa-YFP).</e…

Discussion

Una de las limitaciones inherentes de este protocolo es que se basa en la cultivabilidad de organismos microbianos. Como ha sido bien documentado ^24, mayoría de la vida microbiana en el planeta no puede (aún) ser cultivado bajo las condiciones de cultivo explorados hasta la fecha. Por lo tanto, un gran número de interacciones entre especies microbianas que se están produciendo en los entornos naturales no sea detectada utilizando este enfoque. Sin embargo, ya que es nuestro deseo para identificar no sólo…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.