Questo protocollo descrive l'uso della spettrometria di massa MALDI-TOF a cellula intera su cellule eucariotiche. Qui, illustriamo l'accuratezza di questa tecnica analizzando gli stati di attivazione multipli dei macrofagi in risposta al loro microambiente.
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Articolo metodologico
Whole-cell MALDI-TOF spettrometria di massa è un metodo accurato e rapido per analizzare diverse modalità di attivazione dei macrofagi
In questo articolo
Sommario
Abstract
MALDI-TOF è una tecnica di spettrometria di massa ampiamente utilizzata in chimica e biochimica. È stato anche applicato in medicina per identificare molecole e biomarcatori. Recentemente, è stato utilizzato in microbiologia per l'identificazione di routine di batteri cresciuti da campioni clinici, senza fasi di preparazione o frazionamento. Noi e altri abbiamo applicato con successo questa tecnica di spettrometria di massa MALDI-TOF a cellula intera alle cellule eucariotiche. Le applicazioni attuali spaziano dall'identificazione del tipo di cellula al controllo di qualità, alla valutazione delle colture cellulari e alle applicazioni diagnostiche. Qui, descriviamo il suo utilizzo per esplorare i vari fenotipi di polarizzazione dei macrofagi in risposta a citochine o batteri uccisi dal calore. Ha permesso l'identificazione di impronte digitali specifiche dei macrofagi che sono rappresentative della diversità delle risposte proteomiche dei macrofagi. Questa applicazione illustra l'accuratezza e la semplicità del metodo. Il protocollo qui descritto può essere utile per studiare la risposta immunitaria dell'ospite in condizioni patologiche o può essere esteso ad applicazioni diagnostiche più ampie.
Introduzione
La spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF MS) è una tecnica di spettrometria di massa popolare per studiare campioni biologici. L'utilizzo di un raggio laser e di una matrice ad assorbimento di energia consente un processo di ionizzazione morbida: l'evaporazione e la genesi di grandi biomolecole per lo più a carica singola. Questo processo è chiamato desorbimento/ionizzazione, giustificando l'acronimo MALDI. Questi ioni vengono poi accelerati mediante applicazione di tensione ed entrano in un analizzatore TOF che permette la separazione di questi ioni e la quantificazione delle rispettive masse1<....
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Protocollo
Nel presente protocollo, la tecnica MALDI-TOF a cellula intera viene utilizzata per ottenere uno spettro di massa considerato come un'impronta digitale del campione. Un'analisi bioinformatica ha permesso il confronto e la classificazione di queste impronte digitali. Questo protocollo prevedeva tre parti principali:
- La preparazione dei campioni biologici: controllo dei macrofagi e dei macrofagi stimolati con diversi agonisti.
- L'analisi di ogni tipo di campione con repliche tecniche mediante MALDI-TOF MS a cellula intera.
- L'analisi bioinformatica dei dati grezzi.
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Risultati
L'obiettivo del presente protocollo è dimostrare l'accuratezza della spettrometria di massa MALDI-TOF su cellule intere per valutare la risposta dei macrofagi al loro microambiente.
Figura 1 descrive la preparazione di macrofagi stimolati da campioni di sangue. Figura 2 rappresenta l'analisi di monociti e MDM mediante citometria a flusso. Si noti che i monociti esprimevano CD14 ma non CD68 (Figura 1A). Al contrario, gli MDM esprimevano CD68 ma.......
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Discussione
Questo protocollo descrive l'uso di MALDI-TOF-MS su cellule intere eucariotiche. Qui, illustriamo l'accuratezza del metodo analizzando i molteplici stati di attivazione dei macrofagi in risposta al loro microambiente.
Il successo del protocollo si basa su pochi passaggi critici. Innanzitutto, qualsiasi contaminante in soluzione può alterare gli spettri. Ad esempio, è importante lavare le cellule nella PBS per rimuovere il terreno di coltura e le proteine del siero prima della deposizione sul b.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare. RO, JLM e CC sono inventori di un brevetto internazionale WO 2011/154650, denominato "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".
Ringraziamenti
Richard Ouedraogo è supportato da una sovvenzione del Ministère de la Santé (PHRC 2010). Ringraziamo Laurent Gorvel, Christophe Flaudrops e Nicolas Amstrong per l'assistenza tecnica.
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Riferimenti
- Mass Gross, J. Spectrometry: A Textbook. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).
- Villanueva, J., et al. Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry. Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).
- D....
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Ristampe e permessi
