Summary
O transplante celular representa uma estratégia para o tratamento da degeneração da retina caracterizada pela perda de fotorreceptor. Aqui descrevemos um método de enriquecimento de fotorreceptores transplantáveis e seu enxerto subretinal em camundongos adultos.
Abstract
A deficiência visual e a cegueira devido à perda das células de sensoriamento de luz da retina, ou seja, fotorreceptores, representam a principal razão para a incapacidade nos países industrializados. A substituição de fotorreceptores degenerados por transplante celular representa uma possível opção de tratamento em futuras aplicações clínicas. De fato, estudos pré-clínicos recentes demonstraram que fotorreceptores imaturos, isolados da retina do camundongo neonatal no pós-natal dia 4, têm o potencial de se integrar à retina do camundongo adulto após o transplante subretinal. As células doadoras geraram uma morfologia fotorreceptora madura, incluindo segmentos internos e externos, um corpo de células redondas localizado na camada nuclear externa, e terminais sinápticos próximos a células bipolares endógenas. De fato, relatórios recentes demonstraram que os fotorreceptores doadores se integram funcionalmente aos circuitos neurais dos camundongos hospedeiros. Para uma futura aplicação clínica de tal abordagem de substituição celular, suspensões purificadas das células de escolha devem ser geradas e colocadas na posição correta para a adequada integração ao olho. Para o enriquecimento dos precursores do fotorreceptor, a classificação deve ser baseada em antígenos de superfície celular específicos para evitar a modificação genética das células doadoras. Aqui mostramos a classificação celular associada a magnético (MACS) - enriquecimento de precursores fotorreceptor de haste transplantáveis isolados da retina neonatal de camundongos repórteres específicos do fotorreceptor com base no marcador de superfície celular CD73. A incubação com anticorpos anti-CD73 seguidos por anticorpos secundários conjugados por micro-contas permitiu o enriquecimento de precursores fotorreceptor de haste pelo MACS para aproximadamente 90%. Em comparação com a citometria de fluxo, o MACS tem a vantagem de que pode ser mais fácil aplicado aos padrões GMP e que altas quantidades de células podem ser classificadas em períodos relativos curtos de tempo. A injeção de suspensões celulares enriquecidas no espaço subretinal de camundongos adultos do tipo selvagem resultou em uma taxa de integração 3 vezes maior em comparação com suspensões celulares não sortidas.
Introduction
A visão é um dos principais sentidos dos humanos. O comprometimento desse sentido e da cegueira são uma das principais razões para a incapacidade nos países industrializados. A causa predominante para comprometimento da visão ou cegueira é a degeneração da retina, caracterizada pela perda celular fotorreceptora, pois pode ser observada na degeneração macular, retinite pigmentosa, distrofia cone-rod e outras condições. Até o momento, uma terapia eficaz para restaurar a visão perdida não está disponível. Em 2006 e 2008, dois laboratórios diferentes relataram, independentes um do outro, um transplante bem sucedido de células precursoras de fotorreceptor de varas em retinas de camundongos adultos do tipo selvagem1,2. Assim, decorrente da possibilidade de transplante de células precursoras fotorreceptores também em uma retina degenerada, para substituir fotorreceptores degenerados e restaurar a visão. De fato, foi demonstrado recentemente que tais células precursoras fotorreceptoras transplantadas provocam critérios morfológicos de fotorreceptores maduros do tipo selvagem, como segmentos externos devidamente desenvolvidos3, terminais sinápticos próximos a células bipolares endógenas e um corpo de células redondas localizados na camada nuclear externa2-4,bem como a capacidade de integrar-se funcionalmente ao circuito neural hospedeiro5-7. Um dos principais princípios dessa estratégia é o uso do pós-natal dia 4 (PN 4, PN0 é definido como dia de nascimento) retinas de camundongos jovens, resultando em uma mistura de diferentes tipos de células para transplante. No pano de fundo de uma futura aplicação terapêutica, essa mistura deve ser purificada para células precursoras fotorreceptoras. CD73 foi descrito como o primeiro marcador de superfície celular específico para fotorreceptores jovens na retina8-10. Aqui, demonstramos um método de purificação celular precursora fotoreceptor baseado neste marcador de superfície celular e com o uso da técnica de classificação celular associada a magnético (MACS). O MACS pode ter vantagens em comparação com as técnicas de classificação celular ativadas por fluorescentes, devido aos tempos de triagem rápidos e ao ajuste mais fácil às condições de GMP. Poderíamos demonstrar um enriquecimento de ~90% e uma taxa de integração até 3 vezes maior ao transplantar a população enriquecida para o espaço subretinal em retinas adultas do tipo selvagem. Assim, o enriquecimento celular precursor do fotoreceptor baseado em MACS e o transplante subretinal são técnicas confiáveis e promissoras para o desenvolvimento de uma estratégia terapêutica regenerativa para o tratamento da degeneração da retina.
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Protocol
Uso ético e cuidado com a declaração dos animais:
Todos os experimentos em animais foram realizados em estrita conformidade com as leis da União Europeia e da Alemanha (Tierschutzgesetz) e aderiram à Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão. Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo comitê de ética animal do TU Dresden e do Landesdirektion Dresden (número de aprovação: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Antes de iniciar a dissociação celular e a classificação celular
- Rotule três tubos de reação de 15 ml com: Lavagem (W), Fração positiva (+) e fração negativa (-).
2. Dissociação da retina
- Decapitar os filhotes PN 4 usando uma tesoura.
- Enxágüe a cabeça dos filhotes em pouco tempo em 70% de etanol seguido de lavagem na PBS.
- Transfira a cabeça para o HBSS frio e enuclear o olho (repita este passo para todas as cabeças). Para enuclear, abra as pálpebras e fixe o olho com fórceps curvos na região do nervo óptico. Em seguida, puxe o olho cuidadosamente para fora da órbita.
- Depois de enuclear todos os olhos, isole a retina: introduza uma tesoura fechada no nervo óptico e abra as lâminas. Peal o RPE/chorid para fora. Remova as lentes e vasos sanguíneos usando fórceps curvos.
- Transfira as retinas isoladas para um tubo de reação de 1,5 ml contendo a solução papain (fornecida pelo kit de dissociação papain).
- Incubar as retinas na solução papan por 30-60 min em um banho de água ou shaker (400 rpm) a 37 °C.
- Enquanto as retinas incubam na solução papain, pipeta 1 ml de solução ovomucóide para um tubo de reação de 15 ml (rótulo "1").
- Adicionar 60 μl de DNase I (10 mg/ml) + 60 μl de solução ovomucoid (fornecida pelo kit) + 520 μl de EBSS a um tubo de reação de 15 ml (rótulo "2").
- Após a incubação do papain, transfira a solução de papain contendo as retinas parcialmente digeridas para o tubo de reação "2".
- Usando uma pipeta polida de fogo, realize a dissociação mecânica (10x para cima e para baixo).
- Pipeta a suspensão de célula única ao tubo de reação "1". Tente gerar 2 camadas colocando suavemente a suspensão da célula em cima da solução ovomucoid.
- Centrífuga por 5 min a 300 x g (aproximadamente 1.300 rpm).
- Descarte o supernatante e resuspenque as células em 500 μl de tampão MACS.
3. Classificação celular usando classificação celular associada magnética (MACS)
- Adicione o anticorpo anti-CD73 de rato X μl aos 500 μl, a fim de alcançar uma concentração final de 10 μg/ml.
- Incubar 5 minutos no gelo.
- Encha o tubo de reação de 15 ml a 10 ml com tampão MACS e centrífugue por 5 minutos a uma velocidade de 300 x g.
- Remova o supernatante.
- Resuspenque a pelota em 480 μl de tampão MACS e adicione 120 μl de microesferas IgG anti-rato de cabra.
- Incubar 15 min no gelo; não agitar, agitar ou misturá-lo.
- Encha o tubo de reação de 15 ml a 5 ml com tampão MACS e centrífugue por 5 min a 300 x g.
- Como o tubo de reação é centrifuado:
- Ajuste uma coluna LS no suporte magnético.
- Coloque o filtro de pré-configuração em cima da coluna LS.
- Hidrate o filtro de pré-esparação e a coluna LS com tampão MACS de 3 ml e colete o tampão MACS no tubo de lavagem (W).
- Remova o supernatante.
- Resuspenda a pelota em 500 μl tampão MACS.
- Carregue a suspensão celular de 500 μl no filtro e adicione 1 ml de tampão MACS ao filtro e colete a fração negativa no tubo de reação de fração negativa (-).
- Em seguida, adicione 3 x 3 ml de tampão MACS à coluna para lavar as células que não estão ligadas à coluna
- Uma vez que estes 9 ml estejam através da Coluna LS, remova a coluna do suporte magnético e instale-a em cima do tubo de reação de fração positiva (+).
- Carregue rapidamente 5 ml de tampão MACS na coluna LS e coloque o êmbolo na Coluna LS e pressione-o até que todo o buffer esteja através da coluna.
- Centrifugar o tubo de reação contendo a fração positiva por 5 min a 300 x g.
- Remova o supernatante, resuspenda em 500 μl de tampão MACS e mantenha a 4 °C.
- Conte a quantidade total de células usando um dispositivo comum de contagem de células.
- Prepare uma suspensão celular a partir da fração classificada positiva contendo 2 x 105 células/μl no buffer MACS e mantenha a 4 °C
4. Transplante de células precursoras do fotoreceptor classificados pelo MAC na Retina do Rato
- Certifique-se de ter todas as seguintes soluções prontas: 1 ml de PBS ou HBSS estéreis, 10 μl DNAse I, 1-2 ml estéril desionizado H2O, alíquotas das frações de suspensão celular a 4 °C.
- Anestesiar o camundongo adulto (ou seja, 2-4 meses de idade) com uma injeção intraperitoneal de cloridrato de medetomidina (0,01 mg/10 g de peso corporal), cetamina (0,75 mg/10 g de peso corporal). Em seguida, faça uma injeção subcutânea de Buprenorfina (0,05 mg/kg de peso corporal) para alívio da dor.
- Dilatar pupilas com queda de Fenilefrino 2,5%-Tropicamid 0,5%.
- Fixar o mouse no suporte da cabeça do mouse e colocar sob microscópio estéreo.
- Aplique uma gota de gel vísico para evitar a secagem do olho.
- Faça um pequeno buraco na borda entre esclera e córnea (respectivamente ora serrata) usando uma agulha estéril de 30 G 1/2.
- Corte uma lâmina de cobertura comum em peças pequenas (aproximadamente 5 mm x 5 mm) usando uma caneta de diamante, coloque uma dessas peças em cima da córnea, permitindo visualização direta da retina.
- Lave a seringa microliter presterilizada várias vezes com água deionizada.
- Carregue a seringa microliter com 1 μl de suspensão celular, direcione a agulha tangencialmente através da conjuntiva e esclera e coloque sob controle visual na metade nasal da retina.
- Faça um furo suavemente na retina até chegar ao espaço subretinal, injete a suspensão da célula no espaço subretinal.
- Observe o descolamento bolhoso da retina, que deve ser uniforme, cobrindo aproximadamente 1/4 do espaço da retina sem qualquer sangramento.
- Retire a seringa suavemente, o orifício da retina sela automaticamente.
- Lave a seringa microlitera várias vezes com água deionizada.
- Solte o mouse do suporte da cabeça.
- Acorde o rato injetando cloridrato de atipamozole para reversão do efeito de cloridrato de medetomidina.
- Coloque o mouse para acordar na câmara escura quente (aproximadamente 25 °C).
- Nos próximos 2 dias após o transplante, a Buprenorfina (0,05 mg/kg de peso corporal) deve ser administrada por injeção subcutânea pela manhã e à tarde para alívio da dor.
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Representative Results
Para avaliar a capacidade dos fotorreceptores de haste de integrar-se à retina do rato, foi utilizada uma linha de repórteres de camundongos, na qual o GFP é impulsionado pelo zíper de leucina de retina neural (Nrl, Nrl-GFP) promotor11. Nrl é o marcador mais antigo de fotorreceptores de vara iniciando sua expressão em E12.5 durante toda a idade adulta, permitindo uma rotulagem específica de células fotorreceptoras de vara de doador.
PN 4 Filhotes de NRL-GFP foram decapitados e olhos foram enucleados. As retinas foram então isoladas e dissociadas usando o método descrito acima. A suspensão celular resultante foi então classificada usando MACS baseados em CD73 (Figuras 1 e 2). Após a classificação mac, analisamos o enriquecimento alcançado durante este procedimento.
Como mostrado na Figura 3A,a suspensão celular inicial (Entrada) continha 30,4% de células GFP positivas, ou seja. fotorreceptores de vara. Após a classificação MAC baseada em CD73, observou-se um enriquecimento de até 86,9% na fração CD73-positive (CD73+) por citometria de fluxo. Na fração CD73-negativo (CD73-) apenas 9,9% de todas as células foram detectadas positivamente para GFP (Figura 3A). O enriquecimento de células positivas NRL-GFP após o MACS baseado em CD73 é adicionalmente visualizado após o revestimento in vitro (Figura 3B).
Após a classificação mac, as células doadoras na fração CD73-positivo foram giradas e resuspended para uma concentração final de 200.000 células/μl. Esta suspensão celular foi ainda utilizada para transplante no espaço subretinal de retinas hospedeiras do tipo selvagem(Figura 4). Três a quatro semanas após o transplante, as retinas do hospedeiro foram fixadas, isoladas e seccionadas. Várias células doadoras se integraram à camada nuclear externa dos hospedeiros e adquiriram a morfologia de fotorreceptores maduros com localização do corpo celular na camada nuclear externa e formação de safifésulas sinápticas e segmentos internos(Figura 5). Fotos detalhadas foram publicadas anteriormente pelo nosso grupo3,8 mostrando um desfecho comparável com células classificadas como FAC transplantadas para hospedar retina por outros grupos4,6,10. Consistente em todos esses estudos é que as células transplantadas permanecem no local da injeção, definida pela retina hospedeira desapegada e não migram para longe. Alguns se integram à retina hospedeira (ou seja, camada nuclear externa), e alguns permanecem no espaço subretinal3. Além disso, foi demonstrado que a distribuição de células doadoras no local de integração depende do tipo de modelo de mouse utilizado5. Não foram detectados sinais agudos de rejeição de hospedeiros/enxertos em transplantes entre camundongos C57BL/6J.
Figura 1. Esquema geral de transplante subretinal de macs purificado fotorreceptor precursores em retina de camundongo adulto. As células doadoras dos filhotes PN 4 Nrl-GFP são isoladas, seguidas pela classificação MAC baseada em CD73 e transplantadas no espaço subretinal de retinas hospedeiras de camundongos. Clique aqui para ver a figura maior.
Figura 2. Enriquecimento de fotorreceptores transplantáveis pelo MACS. A suspensão celular gerada de todas as retinas PN4 coletadas é incubada com anticorpos anti-CD73 de ratos primários seguidos de lavagem e incubação com anticorpos anti-ratos conjugados com microesferas. Anticorpos desvinculados são lavados. A suspensão da célula é passada através de uma coluna LS que está conectada com um suporte magnético. As células que são ligadas por anticorpos permanecem presas à coluna enquanto as células restantes são elucidadas e coletadas (fração CD73-negativa). Finalmente, a coluna LS é removida do suporte magnético e as células restantes são elucidadas e coletadas (fração CD73-positive). Clique aqui para ver o filme completo.
Figura 3. Análise do enriquecimento celular positivo nrl-GFP após classificação MAC baseada em CD73. (A) Antes da triagem, a população inicial de células doadoras continha 30,4% das células positivas nrl-gfp. Após a classificação mac, um enriquecimento de células GFP positivos poderia ser detectado na fração CD73+ (86,9%) enquanto a fração CD73 continha apenas baixas quantidades de células GFP+ (9,9%). (B) Imagem representativa demonstrando o resultado da classificação MAC baseada em CD73 de células PN4 Nrl-GFP. 1 milhão de células de cada fração foram banhadas em tampas revestidas de laminina. As células foram fixadas 4 horas após o revestimento com 4% de PFA por 10 min. As células foram manchadas com DAPI (4',6-diamidino-2-fenilôdole, 1:20.000). Observou-se um enriquecimento significativo das células GFP positivos na fração CD73+ quando comparado com a fração de entrada ou a fração CD73. Clique aqui para ver a figura maior.
Figura 4. Injeção subretinal. Desenho esquemático do processo de transplante na retina do rato adulto. A agulha é inserida através de um orifício na serrata de ora,navegada pelo espaço vitreal, evitando tocar a lente e colocada na retina sob controle visual. Por um empurrão suave, a agulha é perfurada através da retina e colocada no espaço subretinal. Eventualmente, a suspensão da célula é injetada cuidadosamente sob controle visual, avaliando o processo de desprendimento.
Figura 5. Integração de células fotorreceptoras transplantadas. Imagem representativa representando macs integrado baseados em CD73 separou células PN4 NRL-GFP após o transplante na retina do rato adulto. Os precursores do fotorreceptor transplantado integram-se corretamente à camada nuclear externa (ONL) e geram morfologia fotorreceptora madura.
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Discussion
O transplante subretinal de células precursoras fotorreceptoras representa uma ferramenta confiável para alcançar a integração dessas células sensíveis à luz em retinas hospedeiras em números significativos1,2. Isso pode permitir o estabelecimento de uma terapia celular para o tratamento de doenças degenerativas da retina no futuro6. A população de doadores de células, atualmente isoladas das retinas PN 4, é uma mistura de diferentes tipos de células, das quais apenas as células precursoras do fotoreceptor se integram após a injeção subretinal. Usando a classificação MAC baseada em CD73, a proporção de fotorreceptores dentro da suspensão celular doadora pode ser aumentada para ≈ 90% que permite uma taxa de integração aproximadamente 3 vezes maior em retinas hospedeiras de tipo selvagem quando comparadas à população celular não sortida8. Em comparação com a citometria de fluxo, o MACS tem a vantagem de um procedimento de triagem rápida e que pode ser relativamente fácil aplicado aos padrões GMP. A purificação de fotorreceptores transplantáveis é de interesse específico à luz de vantagens recentes para a geração in vitro de fotorreceptores a partir de células-tronco pluripotentes12-14. Culturas de células-tronco pluripotentes diferenciadas são compostas por diversos tipos de células, tornando a disponibilidade de procedimentos de triagem específicos um pré-requisito essencial para seu uso futuro em terapias de transplante celular.
De acordo com o procedimento de purificação do MACS, vários pontos são notáveis, garantindo um fluxo de trabalho sem grandes distúrbios. Quanto maior o número de retinas a serem classificadas, mais tempo é necessário para sua digestão. Após a digestão, durante o procedimento de triagem, a agregação de células deve ser evitada. Isso ocorre preferencialmente antes da adição do anticorpo secundário e durante sua incubação. Neste caso, o agregado deve ser removido imediatamente com uma pipeta. Durante a elução do buffer MACS durante a coleta da fração MACS-negativo, é absolutamente necessário não adicionar mais de 3 ml à coluna. A pressão do buffer para a coluna será muito alta se mais buffer do que 3 ml for adicionado. Isso perturbará a ligação do anticorpo às células e diminuirá a eficiência de classificação. Ao remover a coluna do suporte magnético para começar a coletar a fração MACS positivo, este passo deve ser feito rapidamente. Os 5 ml de tampão MACS devem ser adicionados à coluna o mais rápido possível. Além disso, o mergulho deve ser colocado e pressionado rapidamente até que todo o buffer esteja através da coluna. Não é necessário se preocupar com a pressão aplicada. O buffer MACS é isotônico e pode ser variado. É possível usar tampão FACS, meio de cultura celular, PBS, EBSS ou HBSS. A esterilidade do tampão pode ser alcançada filtrando através de uma membrana de filtro de 0,4 μm.
Após o enriquecimento pelo MACS, um transplante bem-sucedido de células doadoras para o espaço subretinal pode ser alcançado mantendo os seguintes pontos em mente. Uma vez que as células fotorreceptoras parecem ser muito sensíveis ao tratamento ex vivo, não é aconselhável mantê-las em 4 °C por mais tempo do que o necessário. Prossiga para transplante o mais rápido possível. Ao inserir a agulha de injeção no globo ocular, é importante evitar tocar na lente, pois a agulha de metal relativamente afiada pode danificar a lente resultando na indução da uveíte induzida pela lente. O último passo no caminho para o espaço subretinal, a penetração da retina, é crucial. Uma vez que não se observa visualmente se o espaço subretinal é atingido é importante desenvolver um sentimento para a pressão de pressão e resistência tecidual direita. Para testar, se a cabeça da agulha for colocada corretamente, um pequeno volume poderá ser aplicado e o descolamento da retina na cabeça da agulha deve ser cuidadosamente observado. Se um desprendimento redondo e bullous sem sangramento estiver se formando, a posição está correta e o resto da solução pode ser aplicada cuidadosamente. Durante a injeção, a agulha deve permanecer em sua posição para evitar danos adicionais ao tecido. O orifício de retina criado pela agulha de injeção sela sozinho se a agulha for retraída lentamente. Todo o procedimento deve ser feito no mínimo de tempo possível para evitar mais estresse e danos ao animal. Durante o transplante, a suspensão celular tende a se agrupar e bloquear a seringa microliter. Se isso acontecer, sugere-se uma diluição da suspensão celular usando PBS ou HBSS estéreis. Outra possibilidade de superar esse problema é adicionar 1 μl de DNAse I à suspensão celular, para dissolver grupos de DNA de células mortas, que tendem a colar células vivas juntas.
Este protocolo está limitado à classificação magnética das células. Portanto, as células poderiam ser classificadas para apenas um marcador por rodada de classificação. Em comparação com a citometria de fluxo, onde as células poderiam ser classificadas usando diferentes marcadores (incluindo propriedades fisiológicas, bem como diferentes marcadores de superfície celular) ao mesmo tempo, esta é uma grande desvantagem dessa técnica. Sempre que a classificação para diferentes marcadores em uma janela de tempo curto é necessária, a citometria de fluxo pode ser a melhor solução. Além disso, a classificação para propriedades fluorescentes de células, como GFP expresso transgenicamente ou outros marcadores de células de vida não é possível com essa técnica. Atualmente está restrito ao uso de anticorpos de superfície celular que podem ser conjugados com contas magnéticas. No entanto, essa técnica poderia ser ampliada com base nos equipamentos técnicos utilizados.
Como a Miltenyi Biotec é atualmente a única fornecedora de ferramentas de triagem de células magnéticas, não há alternativa disponível até o momento. Para dissociação celular, outras enzimas que o papain (ou seja, trippsin) poderiam ser usadas. Note-se que nosso laboratório obteve os melhores resultados com papain, já que esta parece ser a enzima dissociação mais suave em nossas mãos. A janela de tempo da digestão do papain (30-60 min) é variável. Neste tempo a digestão ideal da janela foi alcançada em nosso laboratório. Tempo de incubação mais curto ou mais longo pode ser necessário dependendo do tamanho da amostra, qualidade da amostra e enzima utilizada. Testes individuais são sugeridos.
Dado que o MACS de um passo único não atinge níveis de pureza tão altos quanto a citometria de fluxo, uma possível aplicação adicional dessa técnica pode ser uma classificação negativa de células prejudiciais indesejadas e potenciais. Lá, a fração celular positiva para um determinado marcador de superfície celular, mas não de interesse pode ser resolvida, deixando a fração de interesse isolada no fluxo através. Isso poderia ser feito com antecedência ou após uma etapa positiva de classificação e permite a maior discriminação de células usando diferentes marcadores de superfície celular, bem como a remoção de células indesejadas, como células de camada alimentador ou células indiferenciadas de culturas pluripotentes de células-tronco com seu potencial risco tumorgênico. Portanto, o MACS pode ser adequado para a purificação de fotorreceptores de culturas celulares ES ou iPS em possíveis aplicações terapêuticas futuras, pois representa um tratamento suave, rápido e simples para a purificação de altas quantidades de células cultivadas. O MACS pode ser facilmente aplicado às condições de GMP, uma vez que os detalhes das etapas de classificação, ou seja, mecânica, fluidos e procedimentos são reduzidos em comparação com a citometria de fluxo. Vale ressaltar que o MACS já é usado rotineiramente em ensaios clínicos para o enriquecimento de células de sangue ou medula óssea. Curiosamente, o MACS pode até ser aplicado em células quando não há um marcador de superfície celular adequado, introduzindo geneticamente um marcador de superfície para tornar as células "competentes" para as etapas subsequentes de classificação celular magnética15.
Em resumo, o MACS representa uma ferramenta confiável e rápida para enriquecer células precursoras fotorreceptoras usando marcadores de superfície celular para estudos de transplante. Além disso, é um método facilmente empregável para futuras aplicações clínicas que requerem condições de GMP.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Gostamos de agradecer a Anand Swaroop por fornecer ratos NRL-GFP, Jochen Haas para suporte técnico, e Sindy Böhme e Emely Lessmann pela criação animal.
Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Centro de Terapias Regenerativas Dresden, o Programa de Concessão de Sementes crtd, o SFB 655, e o ProRetina e.V. fundação, o Programa de Pós-Graduação DIGS-BB Dresden, e a Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
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