मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो द्वारा Enucleating घटनाक्रम में एक murine लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका subpopulation समृद्ध की पहचान
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल cytometry, मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रवाह द्वारा orthochromatic erythroblasts enucleating लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका स्पष्टीकरण प्रक्रिया का एक दृश्य प्रदान की आबादी की पहचान करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करता है.
Abstract
स्तनधारियों में एरिथ्रोपोएसिस reticulocyte गठन में यह परिणाम है कि स्पष्टीकरण के नाटकीय प्रक्रिया के साथ समाप्त. स्पष्टीकरण का तंत्र अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है. माइक्रोस्कोपी द्वारा enucleating erythroblasts भीतर प्रमुख प्रोटीन और संरचनाओं के स्थानीयकरण का अध्ययन सामना करना पड़ा जब एक आम समस्या स्पष्टीकरण के दौर से गुजर कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या में निरीक्षण करने के लिए मुश्किल है. हम प्रवाह में Multiparameter उच्च गति सेल इमेजिंग (मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो), कुशलता enucleating की घटनाओं का एक महत्वपूर्ण संख्या की पहचान करने के क्रम में, प्रवाह cytometry साथ immunofluorescent माइक्रोस्कोपी को जोड़ती है एक विधि का उपयोग कर एक उपन्यास विश्लेषण प्रोटोकॉल विकसित किया है, जो करने के लिए अनुमति देता है माप प्राप्त और सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं.
हम यहाँ पहली बार murine erythroblasts सिंक्रनाइज़ और वें पर स्पष्टीकरण पर कब्जा करने की संभावना को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया दो में इन विट्रो एरिथ्रोपोएसिस संस्कृति विधियों का वर्णनमूल्यांकन के ई समय. फिर, हम बहु – वर्णक्रमीय इमेजिंग फ्लो द्वारा स्पष्टीकरण दौरान intracellular प्रोटीन या लिपिड rafts का स्थानीयकरण का अध्ययन करने के क्रम में विस्तार से निर्धारण और permeabilization के बाद erythroblasts के धुंधला वर्णन. आकार और orthochromatic erythroblasts की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है जो DNA/Ter119 धुंधला के साथ, हम लम्बी कोशिकाओं और "डेल्टा केन्द्रक XY Ter119/Draq5 की मान्यता में एड्स कि उज्ज्वल क्षेत्र चैनल में एक सेल के मापदंडों" पहलू अनुपात "का उपयोग "कि Ter119 धुंधला (नवजात reticulocyte) के केंद्र दूर DRAQ5 धुंधला (नाभिक के दौर से गुजर बाहर निकालना) के केन्द्र से है जिसमें सेलुलर घटनाओं, की पहचान इस प्रकार व्याख्या करना करने के बारे में एक सेल का संकेत देता है. उच्च डेल्टा केन्द्रक और कम पहलू अनुपात के साथ orthochromatic लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका जनसंख्या का सबसेट अत्यधिक कोशिकाओं enucleating में समृद्ध है.
Introduction
स्तनधारियों में एर्य्थ्रोइद वंश के भीतर टर्मिनल भेदभाव orthochromatic लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका एक reticulocyte 2 पैदा करने, अपनी झिल्ली encased नाभिक (pyrenocyte) 1 expels जिसके माध्यम से स्पष्टीकरण की नाटकीय प्रक्रिया, के साथ समाप्त. भी सफल की दर सीमित कदम है जो इस प्रक्रिया की सटीक व्यवस्था, बड़े पैमाने पर, इन विट्रो में लाल रक्त कोशिकाओं के उत्पादन, अभी तक पूरी तरह स्पष्ट नहीं है. enucleating erythroblasts भीतर प्रमुख प्रोटीन और संरचनाओं के स्थानीयकरण फ्लोरोसेंट और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3-5 के उपयोग पर निर्भर करता है. इस थकाऊ प्रक्रिया आम तौर पर स्पष्टीकरण की घटनाओं का एक सीमित संख्या की पहचान में यह परिणाम है और हमेशा सार्थक सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति नहीं है. मैक्ग्रा एट अल. 6 द्वारा पहले से वर्णित लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका की पहचान की एक विधि पर विस्तार, हम मल्टी स्पेक्ट्रल भारतीय सैन्य अकादमी से स्पष्टीकरण की घटनाओं की पहचान और अध्ययन का एक उपन्यास दृष्टिकोण विकसित किया हैमाप प्राप्त और सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए टिप्पणियों के लिए पर्याप्त संख्या प्रदान कर सकते हैं जो ging फ्लो (प्रवाह में Multiparameter उच्च गति सेल इमेजिंग, फ्लो के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी को जोड़ती है एक विधि) 7.
यहाँ, हम erythroblasts सिंक्रनाइज़ और मूल्यांकन के समय पर स्पष्टीकरण पर कब्जा करने की संभावना को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल पहली दो में इन विट्रो एरिथ्रोपोएसिस संस्कृति विधियों का वर्णन. तो फिर हम बहु – वर्णक्रमीय इमेजिंग फ्लो द्वारा स्पष्टीकरण दौरान intracellular प्रोटीन या लिपिड rafts का स्थानीयकरण का अध्ययन करने के क्रम में विस्तार से निर्धारण और permeabilization के बाद erythroblasts के धुंधला वर्णन.
नमूने cytometer एक इमेजिंग प्रवाह पर चलाए जा रहे हैं और एकत्र कोशिकाओं orthochromatic erythroblasts 6 की पहचान करने के लिए उचित gated हैं. Brightfield आईएमए में मापा Orthochromatic erythroblasts तो, उनके पहलू अनुपात के आधार पर विश्लेषण कर रहे हैंging, क्रमशः Ter119 और डीएनए के लिए दाग क्षेत्रों के केंद्रों के बीच की दूरी के रूप में परिभाषित किया गया है जो पैरामीटर डेल्टा केन्द्रक XY Ter119 डीएनए, के लिए अपने मूल्य बनाम. कम पहलू अनुपात और उच्च डेल्टा केन्द्रक XY Ter119/DNA साथ कोशिकाओं की आबादी अत्यधिक कोशिकाओं enucleating में समृद्ध है. / – है – या संयुक्त Rac2 – / – जंगली प्रकार (WT) का उपयोग करना Rac2 पर Rac1 की एमएक्स Cre मध्यस्थता शर्तों को हटाएँ साथ erythroblasts बनाम erythroblasts; Rac3 – / – आनुवंशिक पृष्ठभूमि और मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रवाह के इस उपन्यास विश्लेषण प्रोटोकॉल cytometry, हम हाल ही में स्पष्टीकरण असममित cytokinesis जैसा दिखता है और आरएसी GTPases के हिस्से में विनियमित एक actomyosin अंगूठी के गठन स्पष्टीकरण प्रगति 7 के लिए महत्वपूर्ण है कि कि प्रदर्शन किया.
Protocol
Representative Results
Discussion
यह लाल रक्त कोशिकाओं पूर्व vivo की सफल, बड़े पैमाने पर उत्पादन प्राप्त करने के लिए कुशलता से पुन: पेश करने के लिए सबसे कठिन है कि इन विट्रो एरिथ्रोपोएसिस संस्कृतियों में कदम है, क्योंकि हाल के वर्षो?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Amnis निगम (ईएमडी Milllipore का हिस्सा) से सिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल रिसर्च फाउंडेशन और रिचर्ड डिमार्को, Sherree दोस्त है, और स्कॉट मोर्दकै पर रिसर्च फ्लो कोर धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया K08HL088126 और R01HL116352 (TAK) अनुदान और P30 DK090971 (YZ).
Materials
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25G5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
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