זיהוי של subpopulation מועשר Murine Erythroblast באירועי Enucleating ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חדשה לזיהוי אוכלוסייה של enucleating erythroblasts אורתוכרומטי ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry, מתן להדמיה של תהליך אנוקלאציה erythroblast.
Abstract
Erythropoiesis ביונקים מסתיים בתהליך הדרמטי של אנוקלאציה כי תוצאות היווצרות reticulocyte. המנגנון של אנוקלאציה טרם הובהר במלואו. בעיה נפוצה נתקלה כאשר לומדים את הלוקליזציה של חלבונים ומבני מפתח בתוך erythroblasts enucleating ידי מיקרוסקופ היא הקושי לצפות במספר מספק של תאים עוברים אנוקלאציה. פיתחנו פרוטוקול ניתוח חדשני באמצעות הדמיה multiparameter במהירות גבוהה תא בזרימה (Multi-Spectral Imaging cytometry הזרימה), שיטה המשלבת מיקרוסקופיה immunofluorescent עם cytometry זרימה, על מנת לזהות ביעילות מספר משמעותי של אירועי enucleating, המאפשר ל להשיג מדידות וביצוע ניתוחים סטטיסטיים.
אנחנו הראשונים מתארים כאן שתי שיטות מבחנה התרבות בerythropoiesis משמשות כדי לסנכרן erythroblasts העכברי ולהגדיל את ההסתברות ללכידת אנוקלאציה בהזמן דואר של הערכה. לאחר מכן, אנו מתארים בפירוט את ההכתמה של erythroblasts לאחר הקיבוע וpermeabilization כדי ללמוד את הלוקליזציה של חלבונים תאיים או רפסודות שומנים בדם במהלך אנוקלאציה ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry. יחד עם גודל ומכתים DNA/Ter119 אשר משמשים כדי לזהות את erythroblasts אורתוכרומטי, אנו מנצלים את הפרמטרים "יחס" של תא בערוץ הבהיר השדה שמסייע בזיהוי של תאים מוארכים ו" centroid דלתא XY Ter119/Draq5 "המאפשר זיהוי של אירועים הסלולר שבמרכז מכתים Ter119 (reticulocyte המתהווה) הוא רחוק אחד מהשני מהמרכז מכתים Draq5 (שיחול גרעין עובר), ובכך מצביע על תא עומד enucleate. קבוצת המשנה של אוכלוסיית erythroblast אורתוכרומטי עם centroid דלתא גבוה ויחס נמוך מועשר בenucleating תאים.
Introduction
בידול מסוף בתוך שושלת erythroid ביונקים מסתיים בתהליך הדרמטי של אנוקלאציה, שדרכו erythroblast אורתוכרומטי מגרש הגרעין שלה, עטוף בממברנה (pyrenocyte) 1, שהניבו reticulocyte 2. המנגנון המדויק של תהליך זה, שהוא גם הגבלת צעד שיעור מוצלח, בקנה מידה גדולה, ייצור כדוריות דם אדומים במבחנה, עדיין לא הובהר במלואו. הלוקליזציה של חלבונים ומבני מפתח בתוך erythroblasts enucleating מסתמכת על השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרוני 3-5. תהליך מייגע זה בדרך כלל תוצאות בזיהוי של מספר מצומצם של אירועי אנוקלאציה ולא תמיד מאפשר ניתוח סטטיסטי משמעותי. הרחבת על שיטה של זיהוי erythroblast תוארה בעבר על ידי McGrath et al. 6, פיתחנו גישה חדשנית של זיהוי ולימוד אירועי אנוקלאציה ידי Multi-Spectral אמאגינג cytometry הזרימה (multiparameter הדמיה במהירות גבוהה תא בזרימה, בשיטה המשלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם cytometry זרימה) 7, אשר יכול לספק מספר מספיק של תצפיות כדי להשיג מדידות וביצוע ניתוחים סטטיסטיים.
כאן, אנו מתארים שתי שיטות מבחנה הראשונות בerythropoiesis תרבות משמשות כדי לסנכרן erythroblasts ולהגדיל את ההסתברות ללכידת אנוקלאציה בעת ההערכה. לאחר מכן אנו מתארים בפירוט את ההכתמה של erythroblasts לאחר הקיבוע וpermeabilization כדי ללמוד את הלוקליזציה של חלבונים תאיים או רפסודות שומנים בדם במהלך אנוקלאציה ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry.
דגימות מנוהלות על זרימת הדמיה cytometer והתאים שנאספו הם מגודרים כראוי לזהות erythroblasts אורתוכרומטי 6. אז erythroblasts אורתוכרומטי מנותחים המבוסס על היחס שלהם, כפי שהיא נמדדת בהר"י brightfieldגינג, לעומת ערכם לcentroid דלתא פרמטר XY Ter119-DNA, אשר מוגדר כמרחק בין המרכזים של האזורים המוכתמים עבור Ter119 ו-DNA, בהתאמה. האוכלוסייה של תאים עם יחס נמוך וcentroid דלתא הגבוה XY Ter119/DNA היא מועשר בenucleating תאים. באמצעות wild-type (WT) erythroblasts לעומת erythroblasts עם מחיקת MX-Cre בתיווך מותנית של Rac1 על Rac2 – / – או בשילוב Rac2 – / -; Rac3 – / – רקע גנטי ופרוטוקול ניתוח הרומן הזה של זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry, אנחנו הוכיחו לאחרונה כי אנוקלאציה דומה cytokinesis סימטרי וכי היווצרות טבעת actomyosin מוסדרת בחלקו על ידי GTPases RAC היא חשובה להתקדמות אנוקלאציה 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשנים האחרונות המחקר של אנוקלאציה erythroblast צבר תאוצה גוברת שכן הוא הצעד במבחנת תרבויות erythropoiesis שהוא קשה ביותר להתרבות ביעילות על מנת להשיג ייצור של תאי דם אדומים לשעבר vivo מוצלח, בקנה מידה גדולה. עד לאחרונה, המחקר של אנוקלאציה erythroblast מנוצל מיקרוסקופיה בעיקר ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים זרימת מחקר Cytometry Core בבית החולים לקרן המחקר לילדים בסינסינטי וריצ'רד דימרקו, Sherree חבר, וסקוט מרדכי מחברת Amnis (חלק מEMD Milllipore) לקבלת תמיכה טכנית מומחה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניק K08HL088126 וR01HL116352 (TAK) וDK090971 P30 (YZ).
Materials
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25G5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
- McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
- Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
- Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
- Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
- Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
- Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
- Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
- Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
