Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler<em> Streptococcus pneumoniae</em> Floresan boyalar kullanarak
Summary
Ökaryotlar için görülenden farklı olarak, esas olarak, küçük boyutu olarak bakterilerde ayrıntılı membran depolarizasyon ve iyon konsantrasyonu değişiklikleri, ölçüm zor geleneksel yöntemler yapan çok az çalışma vardır. Burada, biz floresan teknikleri kullanılarak anlamlı Gram-pozitif bir patojen Streptococcus pneumoniae tür olayları izlemek için detay protokolleri.
Abstract
Membran depolarizasyon ve iyon tozları nedeniyle derinden enerjilerine ve sinyal iletiminin gibi hücresel fonksiyonları, darbe yetenekleri biyolojik sistemlerde yaygın olarak incelenmiştir olaylardır. Elektrot kullanımı ve patch-sıkma de dahil olmak üzere hem fluoresan hem de elektrofizyolojik yöntemler, iyi ökaryotik hücrelerde bu olayları ölçmek için geliştirilmiş olmasına rağmen, mikroorganizmalar içindeki etkinlik ölçümü için yöntem daha kompleksi ile bir arada, küçük boyutu göz önüne alındığında geliştirmek için daha zor olduğu kanıtlanmıştır membran koruyucu bakterilerin dış yüzeyi. Streptococcus pneumoniae (pnömokok) ölüm-inisiyasyon çalışmalar sırasında, kutupluluk değişiklikler, bütünlük, ve hücre içi iyon konsantrasyonları dahil membran olayların rolünü aydınlatmak istedim. Literatür taraması, biz çok az çalışma var olduğunu buldu. Diğer araştırmacılar iyon grip ölçmek için radyoizotop alımını ya da denge takip ettixes ve membran potansiyeli ve çoğunlukla Gram-negatif organizmaların çalışmaları, sınırlı sayıda, membran potansiyelini ölçmek için karbosiyanin veya oksonol floresan boyalar kullanılarak, ya da (AM) ester versiyonlarının hücre permeant asetoksimetil bakterileri yüklenirken bazı başarılar görmüştü iyon duyarlı floresan göstergesi boyalar. Bu nedenle Gram-pozitif organizma S. membran potansiyeli, rüptürü ve iyon taşıma ölçmek için protokoller kurulmuş ve optimize pneumoniae. Biz yöntem en iyi şekilde rasyometrik boyaların AM esterleri ile pnömokok yüklemek için, sırasıyla, membran depolarizasyonunu ve kopma ölçmek için hem de bis-oksonol boya DiBAC 4 (3) ve hücre-geçirgen olmayan boya propidyum iyodür kullanılarak protokolleri geliştirilmiştir Fura-2, PBFI ve BCECF bir floresans algılama plaka okuyucusu kullanılarak, Ca2 +, K +, H +, sırasıyla, hücre içi konsantrasyonlarında değişiklikleri tespit etmek. Bu protokoller pnömokok için kendi türünün ilk olarakve bu boyaların büyük çoğunluğu başka bakteri türleri kullanılmıştır edilmemiştir. Bizim protokoller S. için optimize edilmiş olsa pneumoniae, bu yaklaşımlar, diğer bakteri türleri içindeki çalışmaları için mükemmel bir başlangıç noktası oluşturan inanıyoruz.
Introduction
Bizim laboratuvar tümör hücrelerinde apoptoza neden (Tümör hücreleri için öldürücü yapılan insan alfa-laktalbümin için) HAMLET adlandırılan insan sütünden bir protein-lipid kompleksi tespit değil, aynı zamanda bakteri türlerinin 1,2 çeşitli öldürmek mümkün olduğunu sahiptir. Özellikle duyarlı olduğu bulunmuştur Bu tür büyük hassasiyet ve ölüm 2,3 bir apoptoz gibi bir fenotip gösteren Streptococcus pneumoniae (pnömokok) ile, solunum yolu hedef olanlar olmuştur. Membran depolarizasyon ve spesifik iyon taşıma etkinlikleri de tarif edilen ve radyoaktif TPP + iyonları ve JC-1 ve TMRE flüoresan boyalar da dahil olmak üzere, mitokondriyal membran depolarizasyonunu 3 göstermek için kullanılmış olan mitokondri, özellikle ökaryotik hücreler, apoptoz sırasında çok önemli bir etkinlik -5. Böylece, biz çabalarımızı odaklı olarak pnömokokkustan bu zar ilgili özellikleri HAMLET etkisi hakkında daha fazla bilgi edinmek için çalıştıbu süreçte yeni antibakteriyel tedavi ya da aşı adaylarını tanımlamak için büyük bir potansiyele sahip bakterilerde apoptosis-benzeri fenotip, mekanistik bileşenlerin daha iyi anlaşılması.
Bizim mekanik çalışmalar için protokolleri kurmak isteyen olarak, ökaryotik sistemlerde de tarif edilen yöntem aksine, bakteriyel zar, 6,7 elektrofizyolojisi ve iyon taşıma mekanizmaları ayrıntılı olarak, çok az sayıda çalışma olduğunu keşfettiler. Bu, esas olarak daha küçük mikroorganizmaların boyutu ve yüzey mimari, dev protoplast kullanarak bazı çalışmalar, karışık başarı ile gösterilmiş olsa da, özellikle hücre çeperinin mevcudiyeti, bu, yama sıkma gibi geleneksel ökaryotik yöntemleri kullanım için zarın erişilebilirlik sınırlayan atfedilir 8,9. Bu adam gerektirir çünkü bu dev protoplastları ile iş çoğu bakteri türleri için ideal ya da pratik bir yöntem değil gibiipulated bakteri doğal olmayan bir halde ve abiyotik, gerçekleştirilmiştir bakteriyel zarı polarite sınırlı çalışmalar, esas olarak akış sitometrisi kullanılabilir ve siyanin ve oksonol floresan boyaların kullanımı 10-16.
Tek bir zaman noktasında tek bir bakteriden floresans bir araya gelirler, akış sitometrisi yerine, zaman içinde, 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde bakteriyel süspansiyonlar floresan yoğunluğunu tespit etmek için bir floresans saptama plaka okuyucusu kullanmak tercih etti. Bu çok daha büyük sadeliği ile çeşitli zaman noktalarında bir bakteri nüfusunu ve kolaylığı ve sürekli akım sitometri kullanarak elde etmek zordur, uzun zaman süreleri için tüm nüfusun floresan kinetiği izlemek sağladı. (Mitokondri ile kullanım için yukarıda tarif edilenler de dahil olmak üzere) potansiyel duyarlı fluoresan boyalar geniş bir yelpazede test sonra, kullanarak en iyi teknik ve pratik başarıDiBAC 4 adı verilen bis-oksonol boya (3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric asit) trimethine oksonol) polariteli değişiklikleri izlemek için.
Ayrıca, bu aynı zamanda değerli propidyum iyodür (PI) ile membranın bütünlüğüne parazitlerin izlemek bulunmuştur. Bu boya nükleik aside bağlanması üzerine fluoresces ama bakteri zarın bütünlüğünün canlı ölü-lekeleme deneylerinde ölü hücreleri tespit etmek için kullanılan bileşen popüler hale tehlikeye zaman bunu yapmak için tek edebilmektedir. PI ek olarak, SYTOX yeşil ve TO-PRO-1 harekete benzerdir ve daha önce tespit yöntemleri 17 akış sitometrisi kullanılarak birkaç çalışmalarda bakteriler için kullanılmış olan floresan boyalardır. Biz bize nedeniyle verilen bir numunede DiBAC ile eş zamanlı olarak flüoresanını izlemek için izin onun dalgaboyu PI kullanmayı seçti.
Çalışmalarımızda, biz Hamlet'teki, hem de bakteri öldürücü etkinliğe sahip başka bir ilgili protein-lipit kompleksi gözlemledikpnömokok 3,18,26 tedavisi üzerine hem boyaların floresanstaki artış ile gösterildiği gibi bakteri membranının Eloa indükte depolarizasyon ve kopma olarak da bilinir. Her iki kompleksleri için, DiBAC 4 florasan yoğunluğu (3) depolarizasyon kopma önce meydana geldiğini gösteren, önceki PI yoğunluğundaki artışa bağlı artış, olduğu görülmektedir Bu nedenle, bakterisidal protein-lipid komplekslerinin neden olduğu bir özel olay faiz. Bu fark, membranın kırılma gibi kendisinin spesifik olmayan depolarizasyonu neden olabilir yapmak için önemlidir. DiBAC 4 iki ölçüm ve analiz (3) ve PI floresan kinetik eşzamanlı bize fluorometri kullanarak yerine akış sitometri ek bir avantajı, iki zar, olaylar arasındaki bu ilişkiyi incelemek için izin verdi.
Bakteriyel iyon akımına izlemek için, alımını ölçme dahil, radyoizotoplar kullanarak önceki bazı başarı olmuştur45 Ca biz de son yıllarda yapılan çalışmalarda 18, 21 kullanmış pnömokokkustan 19,20, 2 +. Bununla birlikte, bu radyoaktif iyonlar ile çalışan birkaç dezavantajları vardır. Bunlar pahalı olabilir, zaman alıcı ve dağınık ve de ilginç izotopu bağlı olarak, zarar deneyi gerçekleştiren bireysel açığa çıkarabilir. Buna ek olarak, zaman içinde hızlı bir değişim gözlem altında tutmak güçtür. Böylece, iyona duyarlı floresan göstergesi boyalar asetoksimetil (AM) ester versiyonları kullanan ölçüm alternatif bir yöntem döndü. Kendi başına, gösterge boya şarj edilir ve kolay bir şekilde membrandan geçmez, fakat lipofilik ester grubunun eklenmesi ile, şimdi yüksüz molekül, bakterinin zar içinden geçebilir. Iç girdikten sonra, bakteriyel esterazlar yüklü daha önemli hücre çıkmak kabiliyetini yavaşlama ve izin boya t hücre içinde serbest bırakarak boya, ester grubunun ayrılması veo zamanla birikebilir. Bununla birlikte, bu ester boyaların kullanımı sadece yükleme, algılama ve başarı çeşitli yöntemlerle, hücre içi Ca2 + ve H +, 22-24 16 değişiklikleri tespit etmek için bir kaç bakteri türlerinde tanımlanmıştır.
Hücre içi Ca değişiklikleri izlemek için bir arzu ile 2 + ve S. de K + ve H + düzeyleri pneumoniae HAMLET ve diğer bileşikler ile işlenmesi üzerine, başarılı etkili bir bakteri hücrelerine floresan göstergesi boyalar yüklemek için protokolleri oluşturulur. Anyon-taşıyıcıları ve PowerLoad, yükleme verimliliğini artırır Life Technologies tescilli bir bileşik engelleyerek boya tutma gücünü arttırır hem probenesit gerekli bakteri içine etkili yükleniyor. (K + tespit) Fura-2/AM (Ca 2 + algılama), PBFI / AM ve BCECF / AM (H + algılama) başarıyla kapsüllenmemiş ve kapsüllü hem pnömokok st yüklenmiştirbir floresans saptama plaka okuyucusu 18, 21 ile (K + uncoupler) ve CCCP (H + uncoupler) valinomycin gibi ionomisin (Ca 2 + uncoupler) ve iyonoforlar, ilave edildikten sonra, elde edilen flüoresan desen ölçümünü sağlayan yağmurlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Boyutu kutupluluk ve membran bakteri ve içinde iyon konsantrasyonlarında değişiklikler bütünlük değişiklikleri tespit etmek için klasik elektrofizyoloji yöntemler kullanılarak sunulur sınırlamaya rağmen, biz S. bu olayları ölçmek için bir yol tarif ettiğim pneumoniae floresan boyalar kullanılmıştır. Bizim protokolleri ve genel olarak pnömokok bakteri türleri için tarif edilen az biri için tarif edilen kendi türünün ilk vardır. Bir floresans saptama plaka okuyucusu kullan…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Bill ve Melinda Gates Vakfı (Grant 53085), JR Oishei Vakfı ve Amerikan Akciğer Derneği (Hibe RG-123721-N) APH için, ve EAC NIH (NIDCD) burs F31DC011218 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Todd Hewitt | Bacto, BD Diagnostics | 249240 | |
| Yeast Extract | Bacto, BD Diagnostics | 212750 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2) | Invitrogen (GIBCO) | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | DMSO |
| DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) | Molecular Probes | B-438 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Make up in deionized water |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| PowerLoad | Molecular Probes | P10020 | 100X concentrate |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial |
| Fura-2/AM | Molecular Probes | F1221 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| PBFI/AM | Molecular Probes | P1267 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | |
| KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | monobasic |
| K2HPO4 | JT Baker | 4012-01 | dibasic |
| NaOH | JT Baker | 5565-01 | |
| BCECF/AM | Molecular Probes | B1170 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| CCCP | Sigma-Aldrich | Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, | |
| dissipating the electrical potential and the H+ gradient. | |||
| Culture tube | VWR | 53283-802 | Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | Spectronic 20D+ | |
| 15 ml plastic conical tube | Corning | 430790 | |
| Clear 96-well polystyrene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Plate reader | BioTek | Synergy 2 Multi-Mode | |
| Microplate Reader | |||
| Gen5 software | BioTek | Gen5™ Software |
Riferimenti
- Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
- Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).
- Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex. PLoS One. 6 (3), (2011).
- Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria. Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (Δψ m) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
- Dominguez, D. C. Calcium signalling in bacteria. Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).
- Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family. Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).
- Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. A patch-clamp study of Bacillus subtilis. Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).
- Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).
- Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).
- Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).
- Shapiro, H. M. Membrane potential estimation by flow cytometry. Methods. 21 (3), 271-279 (2000).
- Shapiro, H. M. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques. J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).
- Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions. Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).
- Suzuki, H., Wang, Z. -. Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes. Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).
- Breeuwer, P., Abee, T. Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques. Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).
- Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).
- Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death. J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).
- Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential. J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).
- Trombe, M. C. Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence. J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).
- Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
- Futsaether, C. M., Johnsson, A. Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes. Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).
- Tisa, L. S., Adler, J. Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content. J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).
- Werthen, M., Lundgren, T. Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens. J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).
- Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).
- Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against. PLoS One. . 8, (2013).
