Vigilar los cambios en la polaridad de la membrana, membrana Integridad, e intracelular de iones concentraciones en<em> Streptococcus pneumoniae</em> Uso de tintes fluorescentes

Summary

A diferencia de la observada para eucariotas, hay una escasez de estudios que despolarización detalle de la membrana y la concentración de iones cambios en las bacterias, principalmente como su pequeño tamaño hace que los métodos convencionales de medición de difícil. En este sentido, los protocolos de detalle para el seguimiento de estos eventos en el Gram-positivas patógeno significativo Streptococcus pneumoniae utilizando técnicas de fluorescencia.

Abstract

Despolarización de la membrana y de iones flujos son eventos que han sido estudiados ampliamente en los sistemas biológicos debido a su capacidad para afectar profundamente las funciones celulares, incluyendo la energética y transducciones de señal. Aunque ambos métodos fluorescentes y electrofisiológicos, que incluyen el uso de electrodo y el parche de sujeción-, han sido bien desarrollado para la medición de estos eventos en células eucariotas, la metodología para la medición de eventos similares en microorganismos han demostrado ser más difícil de desarrollar dado su pequeño tamaño en combinación con el más complejo la superficie externa de las bacterias de blindaje de la membrana. Durante nuestros estudios de la muerte a la iniciación en el Streptococcus pneumoniae (neumococo), hemos querido dilucidar el papel de los eventos de membrana, incluidos los cambios en la polaridad, la integridad, y las concentraciones de iones intracelulares. Buscando en la literatura, encontramos que existen muy pocos estudios. Otros investigadores habían supervisado la captación de radioisótopos o de equilibrio para medir la gripe ionxes y potencial de membrana y un número limitado de estudios, en su mayoría en los organismos Gram-negativos, habían visto un cierto éxito utilizando carbocianina o oxonol tintes fluorescentes para medir el potencial de membrana, o la carga de bacterias con acetoximetil-célula permeable (AM) versiones de ésteres de sensible a los iones colorantes indicadores fluorescentes. Por lo tanto, establecimos y optimizado los protocolos para medir el potencial de membrana, ruptura, y el transporte de iones en el organismo Gram-positiva S. pneumoniae. Hemos desarrollado protocolos utilizando el colorante de bis-oxonol DiBAC ₄ (3) y el yoduro de propidio tinte-células impermeable para medir la despolarización de la membrana y ruptura, respectivamente, así como los métodos para cargar de manera óptima los neumococos con los ésteres de AM de los colorantes ratiometric Fura-2, PBFI, y BCECF para detectar cambios en las concentraciones intracelulares de Ca ^{2 +,} K ^+, y H ^+, respectivamente, utilizando un lector de placas de detección de fluorescencia. Estos protocolos son los primeros de su tipo para el neumococoy la mayoría de estos tintes no se han utilizado en otras especies bacterianas. Aunque nuestros protocolos han sido optimizados para S. pneumoniae, creemos que estos enfoques deben ser un excelente punto de partida para estudios similares en otras especies bacterianas.

Introduction

Nuestro laboratorio ha identificado un complejo de lípido-proteína de la leche humana llamada Hamlet (para la alfa-lactoalbúmina Hecho letal para las células tumorales) que induce la apoptosis en las células tumorales, sino que también es capaz de matar a una variedad de especies bacterianas ^1,2. Las especies que se han encontrado para ser particularmente sensibles fueron aquellos que se dirigen a las vías respiratorias, con Streptococcus pneumoniae (neumococo) que muestra la mayor sensibilidad y un fenotipo de apoptosis como de la muerte ^2,3. Eventos de transporte despolarización de la membrana y de iones específicos son bien descritos y acontecimientos cruciales durante la apoptosis en células eucariotas, en particular en las mitocondrias, donde se han utilizado radiactivos TPP ⁺ iones y colorantes fluorescentes como JC-1 y TMRE para demostrar la despolarización de la membrana mitocondrial ^{3 -5.} Por lo tanto, tratamos de obtener más información sobre el efecto de la aldea en estas funciones relacionadas con la membrana en el neumococo como nos hemos centrado nuestros esfuerzos paradesarrollar una mejor comprensión de los componentes mecánicos del fenotipo de la apoptosis como en las bacterias, con un gran potencial para la identificación de nuevas terapias antibacterianas o vacunas candidatas en el proceso.

Al tratar de establecer protocolos para nuestros estudios sobre el mecanismo, hemos descubierto que, en contraste con la metodología bien descrita en los sistemas eucariotas, existen muy pocos estudios publicados que detallan los mecanismos de electrofisiología y de transporte de iones del ^6,7 membrana bacteriana. Esto se atribuye principalmente al menor tamaño de los microorganismos y su arquitectura de la superficie, en particular la presencia de la pared celular, que restringe la accesibilidad de la membrana para el uso de métodos convencionales como eucariotas patch clamp, aunque algunos estudios utilizando protoplastos gigantes se han realizado con éxito mixto ^8,9. Como el trabajo con estos protoplastos gigantes no es un método ideal o incluso práctico para la mayoría de especies bacterianas, ya que requiere que el hombrebacterias ipulated en un estado antinatural y abiótico, los estudios limitados de la polaridad de la membrana bacteriana que se han realizado han empleado principalmente citometría de flujo y el uso de cianina y oxonol colorantes fluorescentes ^10-16.

En lugar de la citometría de flujo, que recoge lecturas de fluorescencia individuales de una bacteria a un solo punto de tiempo, se optó por utilizar un lector de placas de detección de fluorescencia para detectar la intensidad de fluorescencia de las suspensiones bacterianas en un formato de placa de 96 pocillos con el tiempo. Esto nos permitió para tratar una población de bacterias en diversos puntos temporales con mucha mayor simplicidad y facilidad, y supervisar continuamente la cinética de fluorescencia de toda la población durante largos períodos de tiempo, lo cual es difícil de lograr usando citometría de flujo. Después de probar una amplia variedad de los colorantes fluorescentes de potencial sensible (incluyendo los mencionados anteriormente para su uso con la mitocondria), hemos logrado el mejor éxito técnico y práctico utilizando latinte bis-oxonol llamado DiBAC ₄ (3) (bis-(ácido 1,3-dibutylbarbituric) oxonol trimetina) para monitorear los cambios en la polaridad.

También nos pareció valioso para supervisar simultáneamente las interrupciones en la integridad de la membrana utilizando yoduro de propidio (PI). Este colorante emite fluorescencia al unirse al ácido nucleico, pero sólo es capaz de hacerlo cuando está en peligro la integridad de la membrana bacteriana, por lo que es el componente popular que se usa para detectar células muertas en los ensayos de tinción vivos muertos. Además de PI, SYTOX verde y TO-PRO-1 son colorantes fluorescentes que son similares en la acción y se han utilizado previamente para las bacterias en unos pocos estudios de citometría de flujo utilizando métodos de detección ^17. Hemos elegido utilizar PI debido a su longitud de onda de excitación que nos permitió monitorear su fluorescencia simultáneamente con DiBAC en una muestra dada.

En nuestros estudios, hemos observado que Hamlet, así como otro complejo lípido-proteína relacionada con la actividad bactericidaconocido como ELOA, la despolarización inducida y de la ruptura de la membrana bacteriana como se indica por el aumento de la fluorescencia de ambos colorantes tras el tratamiento de los neumococos ^3,18,26. Para ambos complejos, se observó que la intensidad de fluorescencia de DiBAC ₄ (3) aumentó antes del aumento en la intensidad de la PI, lo que indica que la despolarización se produjo antes de la ruptura y es, por lo tanto, un evento específico inducido por nuestros complejos lípido-proteína de bactericidas interés. Esta distinción es importante hacer, como la ruptura de la membrana puede causar en sí despolarización inespecífica. Cinética de la medición y análisis tanto DiBAC ₄ (3) y de fluorescencia PI simultáneamente nos permitió examinar esta relación entre los dos eventos de membrana, lo cual es una ventaja adicional del uso de fluorometría lugar de la citometría de flujo.

Para controlar el flujo de iones bacteriana, ha habido cierto éxito anterior con el uso de radioisótopos, incluyendo la medición de la absorción de45 Ca ^{2 +} en el neumococo ^19,20, lo que también hemos utilizado en nuestros estudios recientes ^{18, 21.} Sin embargo, el trabajo con estos iones radiactivos tiene varios inconvenientes. Pueden ser costoso, consume tiempo, y desordenado, y también puede exponer a la persona que realiza el experimento para dañar, dependiendo del isótopo de interés. Además, es difícil controlar los cambios rápidos en el tiempo. Por lo tanto, se volvió hacia un método alternativo de medición que emplea versiones acetoximetilo (AM) de éster de indicador fluorescente colorantes sensibles a iones. Por sí mismo, el colorante indicador está cargado y no pasa a través de la membrana fácilmente, pero con la adición del grupo éster lipófilo, la molécula no cargada ahora puede pasar a través de la membrana de la bacteria. Al entrar en el interior, las esterasas bacterianas escindir el grupo éster, dejando el colorante libre dentro de la célula y otra vez cargada, ralentizando significativamente su capacidad para salir de la celda y permitir que el tinte to se acumulan en el interior a través del tiempo. Sin embargo, el uso de estos colorantes de éster sólo se ha descrito en unas pocas especies bacterianas para detectar cambios en el ^{Ca2 +} intracelular ^22-24 y H ^{+ 16,} con diferentes métodos de carga, la detección, y el éxito.

Con el deseo de controlar los cambios en intracelulares de Ca ^{2 +} y también los niveles de K ⁺ y H ⁺ en S. pneumoniae tras el tratamiento con Hamlet y otros compuestos, que creado con éxito protocolos para cargar de manera eficiente colorantes indicadores fluorescentes en las células bacterianas. Carga eficaz en bacterias necesarias tanto probenecid que aumenta la retención de colorante mediante el bloqueo de los transportadores aniónicos y PowerLoad, un compuesto patentado de Life Technologies que aumenta la eficiencia de carga. Fura-2/AM (detección de Ca ^{2 +),} PBFI / AM (detección de K ^+), y BCECF / AM (detección de H ⁺⁾ se cargaron con éxito en tanto no encapsulado y encapsulado neumocócica stlluvias que permiten la medición de los patrones de fluorescencia resultantes después de la adición de ionóforos, tales como ionomicina (Ca ^{2 +} desacoplador), valinomicina (K ⁺ desacoplador) y CCCP (H ⁺ desacoplador) usando un lector de placas de detección de fluorescencia ^{18, 21.}

Protocol

1. Preparación de los cultivos bacterianos Creciendo cultura para su uso en experimentos En un bloque de calentamiento de 37 ° C, descongelar una congelados en acciones vial de S. pneumoniae y añadir su contenido a 9 ml de fresco, precalentado caldo de Todd-Hewitt con extracto de levadura al 0,5% (TU) para un volumen total de 10 ml en un tubo de cultivo de vidrio. Incubar estáticamente a 37 ° C hasta que el cultivo alcanzó la fase semilogarítmica (600nm…

Representative Results

Para todos los experimentos, hay una muestra y conjunto de condiciones presentes en cada pocillo. Por lo tanto, cada rastreo representa la intensidad de fluorescencia de toda una población de bacterias en el tiempo. Los resultados deben ser fácilmente interpretables, con una clara distinción entre la fluorescencia de las muestras tratadas y la de los controles no tratados. La cinética y el grado de un cambio observado en la fluorescencia podrían proporcionar información sobre el posible mecanismo y la mag…

Discussion

A pesar de la limitación de que el tamaño presenta para el uso de métodos clásicos de electrofisiología para detectar cambios en la polaridad y la integridad de la membrana y los cambios en las concentraciones de iones dentro de las bacterias, hemos descrito una forma de medir estos eventos en S. pneumoniae usando colorantes fluorescentes. Nuestros protocolos son los primeros de su tipo descrito para el neumococo y uno de los pocos que se ha descrito para especies bacterianas en general. Mediante el uso de…

Materials

Todd Hewitt	Bacto, BD Diagnostics	249240
Yeast Extract	Bacto, BD Diagnostics	212750
Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)	Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	DMSO
DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)	Molecular Probes	B-438
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Make up in deionized water
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich
PowerLoad	Molecular Probes	P10020	100X concentrate
Probenecid	Molecular Probes	P36400	Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial
Fura-2/AM	Molecular Probes	F1221	Special packaging (50 µg aliquots)
PBFI/AM	Molecular Probes	P1267	Special packaging (50 µg aliquots)
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143
KH2PO4	JT Baker	3246-01	monobasic
K2HPO4	JT Baker	4012-01	dibasic
NaOH	JT Baker	5565-01
BCECF/AM	Molecular Probes	B1170	Special packaging (50 µg aliquots)
CCCP	Sigma-Aldrich		Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,
			dissipating the electrical potential and the H+ gradient.
Culture tube	VWR	53283-802	Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass
Spectrophotometer	Thermo Scientific		Spectronic 20D+
15 ml plastic conical tube	Corning	430790
Clear 96-well polystyrene microtiter plate	Fisher Scientific	12-565-501
Plate reader	BioTek	Synergy 2 Multi-Mode
		Microplate Reader
Gen5 software	BioTek	Gen5™ Software