בונה הנדסת רקמות מבוססת הפיברין מmyofibroblasts ויישום של אילוצים ומתח כדי לגרום לתא וקולגן ארגון (בעניין)
Summary
מערכת מודל זה מתחילה מג'ל הפיברין myofibroblast-מאוכלס שיכול לשמש כדי לחקור קולגן אנדוגני (מחדש) ארגון בזמן האמת באופן הרסני. מערכת המודל היא מאוד מתכונן, כפי שהוא יכול להיות בשימוש עם מקורות תאים שונים, תוספים בינוניים, וניתן להתאים בקלות לצרכי ספציפיים.
Abstract
תוכן קולגן והארגון בפיתוח רקמות collagenous יכולים להיות מושפע על ידי זני רקמות מקומיים ואילוץ רקמות. מהנדסי רקמות שואפים להשתמש בעקרונות אלה כדי ליצור רקמות עם ארכיטקטורות קולגן מוגדרות מראש. הבנה מלאה של התהליכים שבבסיס המדויקים של שיפוץ קולגן לשלוט ארכיטקטורת הרקמה הסופית, לעומת זאת, היא חסרה. בפרט, מעט מאוד ידוע על הנטייה (מחדש) של סיבי קולגן בתגובה לשינויים בתנאי העמסה מכאניים של רקמות. אנחנו פיתחה במערכת מודל חוץ גופית, בהיקף של-myofibroblast זרע מבני Biaxially-מוגבלים הפיברין, על מנת להבהיר עוד יותר קולגן (מחדש) בתגובה לנטייתי) חוזר biaxial לתנאי העמסה סטטיים uniaxial ו-II) טוען uniaxial המחזורי של Biaxially-מוגבל מבנים לפני ואחרי שינוי בכיוון טעינה, עם שימוש במכשיר טעינת FX4000T Flexcell. זמן לשגות הדמיה confocal משמשת לVIsualize קולגן נטייה (מחדש) באופן הרסני.
תא וקולגן הארגון במבנים ניתן דמיינו בזמן אמת, ומערכת ייחוס פנימית מאפשרת לנו להעביר את התאים ומבני קולגן לניתוח זמן לשגות. היבטים שונים של מערכת המודל יכולים להיות מותאמים, כמו מקור תא או שימוש בתאים בריאים וחולים. תוספים יכולים לשמש כדי להבהיר מנגנוני שיפוץ קולגן בסיסי עוד יותר, על ידי למשל הוספת MMPs או חסימת integrins. צורה וגודל של המבנה ניתן להתאים בקלות לצרכי ספציפיים, וכתוצאה מכך מערכת מודל מתכונן מאוד ללמוד תא וקולגן ארגון (מחדש).
Introduction
יש לי רקמות לב וכלי דם פונקציה בולטת נושאת עומס. בתוכן מסוים וארגון של סיבי קולגן במטריקס לתרום למאפייני עומס הנושאות ולשלוט בכוח רקמות כללי 1. בהנדסת רקמות משמש מיזוג מכאני של המבנה – בדרך כלל בהיקף של (מחזורי) משטרים מתאמצים – על מנת לשפר את הארגון ורקמות תכונות מכאניות 2,3. הבנה מלאה של ארגון קולגן מושרה מתח ברקמות גיאומטריות מורכבות כדי ליצור רקמות עם ארכיטקטורת קולגן מוגדרת מראש עדיין לא הושגה. זה נובע בעיקר מהידע המוגבל שלנו של שיפוץ קולגן ברקמות מתפתחות. מודלים קיימים בעיקר לתת מידע על התוצאה הסופית של שיפוץ הנקי קולגן עם שימוש בלחץ סטטי 4-6. כאן אנו מספקים מערכת מודל מתכונן מאוד שמאפשרת הלימוד של ארגון קולגן (מחדש) באופנה בזמן אמת, ב-3D, תחת השפעהעומס סטטי או מחזורי. מבני הרקמות הם מבוססי הפיברין, על מנת להבטיח שכל קולגן במבנה הוא אנדוגני. תא וקולגן ארגון במבנים הוא דמיינו, ומערכת ייחוס פנימית מאפשרת לנו להעביר את התאים ומבני קולגן לניתוח זמן לשגות. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של מערכת המודל לתאי Saphena הנבוב אנוש (HVSCs), שכן תאים אלה ידועים לייצור שלהם המשופר הנוסף הסלולרי מטריצה והיכולת לשפץ את המטריצה והשימוש שלנו הוקם ברקמות מהונדסות 7 לב וכלי דם, המבוסס על עבודתו של דה יונגה et al. 8
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת המודל המתוארת של מבני הפיברין תא מאוכלסים יש פוטנציאל גדול למחקר של תאים וקולגן (מחדש) ארגון (דה יונגה et al. 15), למשל, כדי לשמש למטרות הנדסת רקמות. באמצעות הפיברין כנשא התא הראשוני, אחרי השפלת הפיברין, רקמה נוצרה עם תאים ומטריקס אנדוגני בלבד. בדרך זו,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה בוצע בתכנית המחקר של החומרים ביו (BMM) המכון. BMM הוא cofunded על ידי המשרד ההולנדי לעניינים כלכליים, חקלאות וחדשנות. התרומה הכספית של Hartstichting Nederlandse הוא הודה בהכרת תודה.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
Riferimenti
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).
- Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents. Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).
- Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling. Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).
- Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).
- Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy. Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).
- Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions. Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).
- Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).
- Schnell, A. M., et al. Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts. Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).
- Mol, A., et al. Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application. Circulation. , I152-I158 (2006).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).
- John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels. Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).
- Rubbens, M. P., et al. Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue. Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).
- Chen, W. L., et al. Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).
- Merryman, W. D., et al. Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis. Am. J. Physiol. 290, (2006).
- Ingber, D. E. From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009. Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).
- Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).
- van der Schaft, D. W., et al. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).
