Ingegneria fibrina a base di tessuto costrutti da miofibroblasti e applicazione di vincoli e la tensione per indurre Organizzazione cellulare e collagene (Re)
Summary
Questo sistema modello parte da un gel di fibrina myofibroblast popolata che può essere usato per studiare collagene endogeno (ri) organizzazione in tempo reale in modo non distruttivo. Il sistema modello è molto sintonizzabile, in quanto può essere usato con sorgenti cellulari differenti, additivi medie, e può essere facilmente adattato alle esigenze specifiche.
Abstract
Contenuto di collagene e di organizzazione per lo sviluppo di tessuti di collagene possono essere influenzati dai ceppi dei tessuti locali e di vincolo dei tessuti. Ingegneri dei tessuti hanno lo scopo di utilizzare questi principi per creare tessuti con architetture collagene predefiniti. Una piena comprensione delle esatte sottostanti processi di rimodellamento del collagene per controllare l'architettura del tessuto finale, però, è carente. In particolare, si conosce poco l'orientamento (ri) delle fibre di collagene in risposta ai cambiamenti nelle condizioni di carico meccanico del tessuto. Abbiamo sviluppato un sistema modello in vitro, composto da bi-costretti myofibroblast testa di serie fibrina costrutti, per chiarire ulteriormente il collagene (ri) orientamento in risposta ad i), tornando biassiale a condizioni di carico statico monoassiali e ii) ciclica monoassiale carico del bi-vincolato costrutti prima e dopo un cambio di direzione del carico, con l'uso del dispositivo di caricamento Flexcell FX4000T. Time-lapse imaging confocale viene utilizzato a visualize collagene orientamento (ri) in modo non distruttivo.
Organizzazione cellulare e collagene nei costrutti possono essere visualizzati in tempo reale, e di un sistema di riferimento interno ci permette di trasferire le cellule e le strutture di collagene per l'analisi time-lapse. Vari aspetti del sistema modello può essere regolata, come fonte cellulare o l'uso di cellule sane e malate. Additivi possono essere utilizzati per chiarire ulteriormente i meccanismi sottostanti rimodellamento del collagene, per esempio con l'aggiunta di MMPs o blocco integrine. Forma e dimensioni del costrutto possono essere facilmente adattati alle esigenze specifiche, risultante in un sistema modello per lo studio altamente sintonizzabile organizzazione cellulare e collagene (ri).
Introduction
Tessuti cardiovascolari hanno una funzione di primo piano portante. In particolare, i contenuti e l'organizzazione delle fibre di collagene nella matrice extracellulare contribuire alle proprietà portanti e dominare la forza del tessuto complessivo 1. In ingegneria dei tessuti è utilizzato condizionata meccanica del costrutto – costituiti in genere da (ciclico) regimi sforzare – per migliorare l'organizzazione dei tessuti e le proprietà meccaniche 2,3. Piena comprensione di organizzazione collagene deformazione indotta in geometrie complesse dei tessuti per creare tessuti con architettura collagene predefinito non è stato ancora raggiunto. Ciò è dovuto principalmente alla nostra conoscenza limitata del rimodellamento del collagene nei tessuti sviluppo. Modelli esistenti forniscono principalmente informazioni sul risultato netto finale di rimodellamento del collagene con l'utilizzo di sforzo statico 4-6. Qui forniamo un sistema modello altamente sintonizzabile che consente lo studio del collagene (ri) organizzazione in un modo tempo reale, in 3D, sotto influenzadi deformazione statica o ciclico. I costrutti tissutali sono basati fibrina, assicurando che tutta collagene nel costrutto è endogena. Organizzazione cellulare e collagene nei costrutti viene visualizzato, e un sistema di riferimento interno ci permette di trasferire le cellule e le strutture di collagene per l'analisi time-lapse. In questo protocollo verrà descritto l'uso del sistema modello per umani Vena safena Cells (HVSCs), poiché queste cellule sono noti per la loro maggiore produzione di matrice extracellulare e la capacità di rimodellare la matrice e il nostro uso stabilita in ingegnerizzati tessuti cardiovascolari 7, basato sul lavoro di de Jonge et al. 8
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema modello descritto costrutti di fibrina cellula-popolate ha un grande potenziale per lo studio della cellula e collagene (ri) organizzazione (de Jonge et al. 15), ad esempio da utilizzare per scopi di ingegneria tissutale. Utilizzando fibrina come il vettore cellula iniziale, dopo la degradazione della fibrina, un tessuto è creato con cellule e unica matrice endogena. In questo modo, le cellule sono stimolate a reagire a ceppo, o statico o ciclico in natura, applicando forze contr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato eseguito nel programma di ricerca dei materiali biomedici (BMM) dell'istituto. BMM è cofinanziato dal ministero olandese degli Affari economici, dell'agricoltura e dell'innovazione. Il contributo finanziario della Hartstichting Nederlandse Si ringrazia.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
Riferimenti
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