Engineering Fibrin-baserte Tissue konstruerer fra myofibroblasts og anvendelse av restriksjoner og belastning å bevege Cell og kollagen (Re) Organisasjon

Summary

Dette modellsystem starter fra et myofibroblast-befolket fibrin-gel som kan brukes til å studere endogen kollagen (re) organisasjon sanntid på en ikke-destruktiv måte. Modellsystemet er meget fleksibel, slik at den kan brukes med forskjellige cellekilder, medium tilsetningsstoffer, og kan enkelt tilpasses til spesifikke behov.

Abstract

Kollagen innhold og organisering i utviklingen collagenous vev kan påvirkes av lokale vev stammer og vev begrensningen. Tissue ingeniører tar sikte på å bruke disse prinsippene til å lage vev med forhåndsdefinerte kollagen arkitekturer. En full forståelse av den nøyaktige underliggende prosesser av kollagen ombygging til å kontrollere den endelige vevsarkitektur, er imidlertid mangelfull. Spesielt er lite kjent om (re) orientering av kollagenfibre i respons til endringer i vev mekaniske belastningsforhold. Vi utviklet en in vitro modell system, bestående av biaksialt med begrenset myofibroblast-seeded fibrin konstruksjoner, for ytterligere å belyse kollagen (re) orientering som svar på i) reverting biaxial til enaksede statiske belastningsforhold og ii) syklisk uniaxial lasting av biaksialt-hemmet konstruksjoner før og etter en endring i lasting retning, med bruk av Flexcell FX4000T lademekanisme. Time-lapse confocal bildebehandling brukes til VIsualize kollagen (re) orientering i en ikke-destruktiv måte.

Celle og kollagen organisasjon i konstruksjoner kan visualiseres i sanntid, og en intern referanse system tillater oss å flytte celler og kollagen strukturer for time-lapse analyse. Forskjellige aspekter av modellen systemet kan justeres, for eksempel celle-kilde eller bruk av friske og syke celler. Additiver kan brukes for ytterligere å belyse mekanismer underliggende kollagen remodellering, ved for eksempel å legge til MMP eller blokkering integriner. Form og størrelse av konstruksjonen lett kan tilpasses til spesifikke behov, noe som resulterer i en meget fleksibel modellsystem for å studere celle og kollagen (re) organisasjon.

Introduction

Hjerte-vev har en fremtredende bærende funksjon. Spesielt innhold og organisering av kollagenfibre i ekstracellulær matrix bidra til bærende egenskaper og dominere totalt vev styrke ^en. I tissue engineering mekanisk condition av konstruksjonen er brukt – vanligvis bestående av (syklisk) straining regimer – for å øke vev organisasjon og mekaniske egenskaper ^2,3. Full forståelse av stamme-indusert kollagen organisasjon i komplekse vev geometrier å lage vev med forhåndsdefinert kollagen arkitektur er ennå ikke oppnådd. Dette er hovedsakelig på grunn av vår begrensede kunnskap om kollagen ombygging i utviklingsland vev. Eksisterende modeller hovedsakelig gi informasjon om den endelige netto resultat av kollagen ombygging med bruk av statisk belastning ^4-6. Her gir vi en svært fleksibel modell system som gjør at studiet av kollagen (re) organisering i en real-time mote, i 3D under påvirkningav statisk eller syklisk belastning. Vevet konstruksjoner er fibrin-basert, noe som sikrer at all kollagen i konstruksjonen er endogen. Celle og kollagen organisasjon i konstruksjoner er visualisert, og en intern referanse system tillater oss å flytte celler og kollagen strukturer for time-lapse analyse. I denne protokollen vil vi beskrive bruken av modellsystemet for Human Vena Saphena Cells (HVSCs), siden disse cellene er kjennetegnet ved forbedret ekstracellulær matriks produksjon og evnen til å fornye matriksen og den etablerte bruk i skreddersydde kardiovaskulære vev ^7, basert på arbeidet til de Jonge et al. ⁸

Protocol

En. Kultur of Human Vena Saphena Cells Isoler celler fra vena Saphena magna, anskaffet fra en giver i henhold til retningslinjene for sekundær bruk materiale, i henhold til protokollen ved Schnell et al. Ni og lagre disse i flytende nitrogen. Fra den delen av vena Saphena magna fra en donor snitt stykker på 2 x 2 mm til kulturen i en seks-brønns plate. Bruk to stykker per brønn. Vanligvis nok celler kan fås til å fylle omtrent 3 ampuller med 0,25 x 10 6 celler i flytende n…

Representative Results

Denne modellen systemet tillater dyrking myofibroblast-seeded fibrin geler. Figur 1A viser en vev dyrket først under statiske biaksiale begrensninger. Tissue begrensninger er utgitt ved å kutte fibrin gel fra to begrensninger, for å skape enaksede statiske begrensninger, og vev komprimerer og remodels etterpå (figur 1A). For syklisk belastning, blir vevet kultiveres under statiske biaksielle begrensninger i tillegg. Etter 5 dager syklisk uniaksial belastning kan påføres (f…

Discussion

Den beskrevne modellsystem av celle-befolkede fibrin konstruksjoner har stort potensial for studiet av cellen og kollagen (re) organisasjon (de Jonge et al. ^15), for eksempel for å bli brukt til vevsmanipuleringsteknikker formål. Ved å bruke fibrin som den første cellen carrier, etter fibrin degradering, er en vev laget med celler og endogen matrix bare. På denne måte blir celler stimuleres til å reagere til belastning, enten statisk eller syklisk av natur, ved å anvende sammentrekni…

Materials

Name	Company	Catalog number	Comments
Culture plastic	Greiner		Includes culture flasks and pipettes
Advanced DMEM	Gibco	12491
Fetal bovine serum	Greiner	758075
Penicillin/streptomycin	Gibco	10378016
GlutaMax	Gibco	35050-079
Elastomer and curing agent	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regular store		You can buy this at a regular store, only use the soft side
Bioflex culture plates	Flexcell Int	BF-3001U	Untreated
L-Ascorbic Acid 2-phosphatase	Sigma	A8960
ε-Amino Caproic Acid	Sigma-Aldrich	D7754
Bovine thrombin	Sigma	T4648
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630
0.45 syringe filter	Whatmann (Schleicher and Scheul)	10462100
Polystyrene microspheres	Invitrogen	F-8829	Blue fluorescent, 10 μm diameter
Flexcell FX-4000T	Flexcell Int		Includes rectangular loading posts
Cell Tracker Orange	Invitrogen Molecular Probes	C2927
CNA35-OG488			Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss		LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode
Amphotericin	Gibco	15290-018	Needed for cell isolation