Engineering fibrinbaserade Tissue konstruktioner från Myofibroblaster och tillämpning av begränsningar och påfrestningar för att inducera cell-och kollagen (om) organisering
Summary
Denna modell startar från en myofibroblast-befolkade fibringel som kan användas för att studera endogent kollagen (om) organisering realtid på ett icke-förstörande sätt. Modellen systemet är mycket avstämbar, eftersom den kan användas med olika cellkällor, medelstora tillsatser, och kan anpassas lätt till specifika behov.
Abstract
Kollagen innehåll och organisation för att utveckla kollagena vävnader kan påverkas av lokala vävnad stammar och vävnad tvång. Tissue ingenjörer strävar efter att använda dessa principer för att skapa vävnader med fördefinierade kollagen arkitekturer. En fullständig förståelse av de exakta bakomliggande processer kollagen ombyggnad för att styra den sista vävnaden arkitekturen, dock saknas. I synnerhet, är lite känt om det (åter) orientering av kollagenfibrer som svar på förändringar i vävnad mekaniska belastningsförhållanden. Vi utvecklade en in vitro modellsystem, bestående av biaxiellt tvungna myofibroblast-seedade fibrin konstruktioner, för att ytterligare belysa kollagen (re) orientering som svar på i) återgå biaxial för enaxliga statiska belastningsförhållanden och ii) cyklisk enaxlig belastning av biaxiellt begränsas- konstruktioner före och efter en förändring i lastning riktning, med användning av Flexcell FX4000T laddningsanordningen. Time-lapse konfokala avbildning används till visualize kollagen (re) orientering i ett icke-förstörande sätt.
Cell-och kollagen organisation i konstruktionerna kan visualiseras i realtid, samt en intern referens systemet tillåter oss att flytta celler och strukturer kollagen för time-lapse-analys. Olika aspekter av modellsystemet kan justeras, liksom cellkälla eller användning av friska och sjuka celler. Tillsatser kan användas för att ytterligare klarlägga mekanismerna bakom kollagen ombyggnad, exempelvis genom att lägga MMP eller blockering integriner. Form och storlek på konstruktionen kan enkelt anpassas till specifika behov, vilket resulterar i en mycket avstämbara modellsystem för att studera cell-och kollagen (om) organisering.
Introduction
Kardiovaskulära vävnader har en framträdande bärande funktion. Särskilt innehåll och organisation kollagenfibrer i den extracellulära matrisen bidrar till bärande egenskaper och dominera totalt vävnad styrka 1. I tissue engineering mekanisk konditionering av konstruktionen används – oftast bestående av (cykliska) ansträngde regimer – att öka vävnad organisation och mekaniska egenskaper 2,3. Full förståelse av stam-inducerad kollagen organisation i komplexa vävnad geometrier för att skapa vävnader med fördefinierade kollagen arkitektur har ännu inte uppnåtts. Detta beror främst på vår begränsade kunskap om kollagen ombyggnad i utvecklingsländer vävnader. Befintliga modeller ger främst information om den slutliga nettot av kollagen ombyggnad med användning av statisk belastning 4-6. Här ger vi en mycket avstämbara modellsystem som möjliggör studier av kollagen (om) organisering i realtid mode, i 3D, under påverkanav statisk eller cyklisk belastning. Vävnaden konstruktionerna är fibrin-baserade, se till att allt kollagenet i konstruktionen är endogen. Cell-och kollagen organisation i konstruktionerna är visualiseras, och ett inre referenssystem tillåter oss att flytta celler och strukturer kollagen för time-lapse-analys. I detta protokoll kommer vi att beskriva användningen av modellen för mänskliga Vena saphena Cells (HVSCs), eftersom dessa celler är kända för deras ökade extracellulära matrix produktion och förmåga att bygga om matrisen och våra etablerade användning i iscensatte kardiovaskulära vävnader 7 baserat, om arbetet i de Jonge et al. 8
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrivna modellen system för cell-befolkade fibrin konstruktioner har stor potential för studier av cell-och kollagen (om) organisering (de Jonge et al. 15), t.ex. för att användas för ändamål tissue engineering. Genom att använda fibrin som den ursprungliga cellen transportören, efter fibrinnedbrytningsprodukter, är en vävnad skapad med celler och endogena matrix bara. På detta sätt stimuleras cellerna att reagera på påfrestningar, antingen statisk eller cyklisk till sin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie utfördes i forskningsprogrammet för de biomedicinska material (BMM) Institute. BMM är samfinansierat av det nederländska ekonomiministeriet, jordbruk och innovation. Det ekonomiska bidraget från Nederlandse Hartstichting är tacksamt erkänns.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
Riferimenti
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).
- Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents. Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).
- Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling. Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).
- Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).
- Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy. Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).
- Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions. Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).
- Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).
- Schnell, A. M., et al. Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts. Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).
- Mol, A., et al. Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application. Circulation. , I152-I158 (2006).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).
- John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels. Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).
- Rubbens, M. P., et al. Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue. Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).
- Chen, W. L., et al. Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).
- Merryman, W. D., et al. Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis. Am. J. Physiol. 290, (2006).
- Ingber, D. E. From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009. Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).
- Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).
- van der Schaft, D. W., et al. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).
