Mühendislik Fibrin tabanlı Doku miyofibroblastlar ve Kısıtlar Uygulamasından Yapıları ve Hücre ve Kollajen (Re) Organizasyon tetikleyebilecek süzün
Summary
Bu model sistem bir tahribatsız şekilde endojen kolajen (yeniden) organizasyonu gerçek zamanlı çalışma için kullanılabilecek bir miyofibroblast nüfuslu fibrin jel başlar. Bu model sistemi, farklı hücre kaynakları, orta katkı maddeleri ile birlikte kullanılabilir gibi çok ayarlanabilir, ve özel ihtiyaçlarına göre kolay bir şekilde adapte edilebilir.
Abstract
Kolajen içerik ve kollajen doku gelişmekte olan organizasyon lokal doku suşları ve doku kısıtlaması tarafından etkilenebilir. Doku mühendisleri önceden tanımlanmış kollajen mimarileri ile dokuları oluşturmak için bu ilkeleri kullanmayı hedefliyoruz. Son mimari dokusu kontrol etmek için kollajen yeniden tam yatan süreçlerin tam bir anlayış, ancak eksik olduğunu. Özellikle, küçük bir doku mekanik yükleme koşullarındaki değişikliklere yanıt olarak kollajen liflerinin (yeniden) yönlendirme hakkında bilinmektedir. Biz daha kollajen aydınlatmak için, iki taraflı-kısıtlı miyofibroblast numaralı seribaşı fibrin yapıları oluşan, in vitro model sistem bir geliştirilen i yanıt olarak (yeniden) yönlendirme) tek eksenli statik yükleme koşulları ve ii iki eksenli geri alma) Çift yönlü-kısıtlı siklik tek eksenli yükleme Flexcell FX4000T yükleme cihazı kullanımı ile, yön değişikliği yükleme öncesi ve sonrası yapıları. Time-lapse konfokal görüntüleme vi için kullanılırbir tahribatsız şekilde kolajen (yeniden) yönlendirme sualize.
Yapıları hücre ve kollajen organizasyon gerçek zamanlı olarak görüntülenmiştir olabilir, ve bir iç referans sistemi bize zaman atlamalı analizi için hücreleri ve kollajen yapı taşınmaya sağlar. Model sisteminin çeşitli yönleri hücre kaynağı ya da sağlıklı ve hastalıklı hücrelerin kullanımı gibi, ayarlanabilir. Katkı maddeleri örneğin MMP ekleyerek veya integrinler tarafından bloke edilmesi için, daha altta yatan mekanizmalar kollajen yeniden aydınlatmak için kullanılabilir. Bu yapı şekli ve büyüklüğü kolayca hücresi ve kollajen (yeniden) organizasyonu incelemek için bir çok ayarlanabilir modeli sistemi ile sonuçlanan, özel ihtiyaçlarına göre adapte edilebilir.
Introduction
Kardiyovasküler dokular önemli bir taşıyıcı fonksiyonu var. Hücre dışı matriks kollajen liflerinin belirli bir içerik ve organizasyonda yük taşıyan özellikleri katkı ve genel doku gücü 1 hakim. Doku mühendisliği yapı mekanik klima kullanılır – genellikle (döngüsel) süzme rejimlerinin oluşan – doku organizasyonu ve mekanik özellikleri 2,3 artırmak için. Önceden tanımlanmış kollajen mimarisi ile doku oluşturmak için karmaşık doku geometrilerde gerginlik kaynaklı kollajen organizasyonu tam bir anlayış henüz elde edilmiştir değil. Bu gelişmekte olan dokularda kollajen yeniden bizim sınırlı bilgi kaynaklanmaktadır. Mevcut modeller ağırlıklı olarak statik zorlanma 4-6 kullanımı ile kollajen yeniden nihai net sonucu hakkında bilgi vermek. Burada etkisi altında, 3D, gerçek zamanlı bir şekilde kolajen (yeniden) örgütün çalışma sağlayan son derece ayarlanabilir model sistem sağlarStatik veya siklik suşunun. Doku yapıları yapı tüm kollajen endojen sağlamak, fibrin tabanlı. Yapıları hücre ve kollajen organizasyon görüntülenmiştir ve bir iç referans sistemi bize zaman atlamalı analizi için hücreleri ve kollajen yapı taşınmaya sağlar. Bu hücreler dayalı olarak gelişmiş hücre dışı matriks üretim ve mühendislik kardiyovasküler dokularda 7 matris ve kurulan kullanım bozulmasina yeteneği, tanınırlar beri bu protokolde, İnsan Vena Saphena Hücreleri (HVSCs) için model sisteminin kullanımı anlatacağım de Jonge ve ark. 8 çalışmalarına
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre kalabalık fibrin yapıların tarif model sistem hücre ve kollajen çalışma için büyük bir potansiyele sahiptir (yeniden) organizasyonu (de Jonge ve ark. 15), doku mühendisliği amaçlar için de kullanılabilir örneğin. Ilk hücre taşıyıcı olarak fibrin kullanarak, fibrin bozulduktan sonra, bir doku hücreleri ve endojen matriste ile oluşturulur. Bu şekilde, hücre sınır sertlik 12 algılama veya gerginlik kaçınma gösteren, kasılma güçleri 16,17…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Biyomedikal Malzemeler (BMM) enstitü araştırma programı uygulandı. BMM Ekonomik işler, Tarım ve İnovasyon Bakanlığı tarafından Hollanda cofunded edilir. Nederlandse Hartstichting mali katkısı minnetle kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
Riferimenti
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).
- Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents. Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).
- Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling. Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).
- Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).
- Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy. Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).
- Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions. Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).
- Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).
- Schnell, A. M., et al. Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts. Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).
- Mol, A., et al. Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application. Circulation. , I152-I158 (2006).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).
- John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels. Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).
- Rubbens, M. P., et al. Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue. Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).
- Chen, W. L., et al. Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).
- Merryman, W. D., et al. Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis. Am. J. Physiol. 290, (2006).
- Ingber, D. E. From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009. Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).
- Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).
- van der Schaft, D. W., et al. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).
