الأعور ربط والبزل التي يسببها تعفن الدم نموذجا لدراسة الالتهام الذاتي في الفئران
Summary
يمكن أن يتسبب الإنتان التجريبية في الفئران باستخدام ربط الأعور وثقب (CLP) الأسلوب. يتم عرض البروتوكولات الحالية لتقييم الالتهام الذاتي في الجسم الحي في سياق الإنتان CLP التي يسببها هنا: بروتوكول لقياس الالتهام الذاتي باستخدام الفئران (GFP) LC3، وبروتوكول لقياس تشكيل جسيم بلعمي ذاتي بواسطة المجهر الإلكتروني.
Abstract
يمكن أن يتسبب الإنتان التجريبية في الفئران باستخدام ربط الأعور وثقب (CLP) الأسلوب، الذي يسبب تعفن الدم متعدد المكروبات. هنا، يتم توفير بروتوكول للحث على الإنتان متفاوتة الخطورة في الفئران باستخدام تقنية CLP. الالتهام الذاتي هو استجابة الأنسجة للإجهاد الأساسية وغزو الممرض. وتعرض اثنين من البروتوكولات الحالية لتقييم الالتهام الذاتي في الجسم الحي في سياق الإنتان التجريبية أيضا هنا. (I) يتعرضون الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتين البروتين مضان أخضر (GFP) LC3 الانصهار لCLP. تعزيز المترجمة من إشارة GFP (نقاط و)، ويعاير إما عن طريق المقايسات المناعية أو متحد البؤر، ويمكن استخدامها للكشف عن تشكيل جسيم بلعمي ذاتي معزز، وبالتالي، وتفعيل غيرت من مسار الالتهام الذاتي. (II) تعزيز فجوة ذاتية البلعمة (جسيم بلعمي ذاتي) تشكيل الأنسجة في منطقة حدة (كعلامة من التحفيز الالتهام الذاتي) يمكن قياسها كميا باستخدام المجهر الإلكتروني. دراسة الاستجابات ذاتية البلعمة لهو تسمم شركات حرجةonent من فهم الآليات التي الأنسجة الاستجابة للعدوى. نتائج البحوث في هذا المجال يمكن أن تسهم في نهاية المطاف نحو فهم الآلية المرضية للتسمم، وهو ما يمثل مشكلة كبيرة في مجال الطب والرعاية الحرجة.
Introduction
الإنتان، والاستجابة الالتهابية الجهازية للإصابة، يمثل السبب الرئيسي للوفاة في مرضى حاسمة من سوء 1. التهابات داخل البطن، وغالبا ما يؤدي إلى تعفن الدم متعدد المكروبات، تمثل 20٪ من حالات الإنتان، والتي لها معدل وفيات كبيرة تصل إلى 60٪ 2. الوفيات المرتبطة الإنتان النتائج في المقام الأول من اختلال وظيفي متعدد الجهاز مع فشل الجهاز اللاحقة 3،4. وهناك حاجة للمزيد من التحقيق في آلية المسببة للأمراض من هذا المرض على وجه السرعة لتعزيز تطوير علاجات جديدة وأكثر فعالية.
أسلوب ربط الأعور وثقب (CLP) هو إجراء يستخدم بشكل شائع لنمذجة الإنتان في الجسم الحي. كما الأعور هو الكامل من البكتيريا، نتائج ثقب في التهاب الصفاق متعدد المكروبات، إزفاء من البكتيريا في الدم (تجرثم الدم)، الصدمة الإنتانية، اختلال وظيفي متعدد الجهاز، وفي نهاية المطاف، والموت 5. ومن المسلم به عموما أن CLP يعكس السريريةالواقع أكثر دقة من التقنيات السابقة، مثل حقن الذيفان الداخلي أو البكتيريا حتى المنقى في القوارض، وهكذا، تعتبر CLP معيار الذهب (وإن كان لا يخلو من قيود) 6 لتحريض التجريبية، وبالتالي، والتحقيق في التسبب في التسمم. في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكولات مصممة لتقييم ما إذا كانت آليات المسببة للأمراض الإنتان تشمل الالتهام الذاتي.
الالتهام الذاتي، عملية الحفظ تطويريا الخلوية، ويسهل دوران من البروتينات والعضيات مثل الميتوكوندريا التالفة ويلعب دورا هاما في إزالة مسببات الأمراض بما في ذلك البكتيريا داخل الخلايا 7،8. خلال الالتهام الذاتي، التي تحتجز البروتينات عصاري خلوي أو العضيات في حويصلات غشاء محدد مزدوجة دعا autophagosomes، والتي يتم تسليمها لاحقا إلى الجسيمات الحالة لتدهور 9. وقد تم تحديد عدد من البروتينات مثل المتماثلات الثدييات من الجينات المرتبطة الالتهام الذاتي (ATG)،حددت أصلا في الخميرة، التي تنظم عملية الالتهام الذاتي. تحويل أنيبيب المرتبطة البروتين 1 سلسلة ضوء 3B (LC3B) (نديد من Atg8) من-I LC3B (شكل حر) لLC3B-II (شكل فسفاتيديل مترافق) يمثل خطوة رئيسية في تشكيل جسيم بلعمي ذاتي 9. ويرتبط ضعف ذاتية البلعمة مع الشيخوخة والأمراض التي تصيب الإنسان بما في ذلك السرطان والاضطرابات العصبية 10. علاوة على ذلك، الالتهام الذاتي يؤثر على المناعة الفطرية والتكيفية مثل العرض مستضد والتنمية اللمفاويات وإفراز السيتوكينات من الخلايا المناعية 8. وبالتالي، فإنه يبدو من المعقول أن الالتهام الذاتي قد تلعب أيضا دورا في الاستجابة الالتهابية الجهازية للإصابة (أي في الإنتان).
حتى هذا التاريخ وقد وصفت عدة طرق لتقييم دور الالتهام الذاتي إلى إصابة نسيج في الجسم الحي. وتشمل هذه استخدام البروتين مخضر (GFP) LC3 الفئران التعبير عن والقياس الكمي لصناعة السياراتphagosomes في الأنسجة بواسطة المجهر الإلكتروني (موصوفة هاتين الطريقتين في هذه الدراسة). وتشمل وسائل إضافية لتقدير حجم ذاتية البلعمة التعبير البروتين في الخليط الأنسجة، وتحليل تدفق ذاتية البلعمة (كما هو موضح في مكان آخر) 11-13. الهدف من هذا الاستعراض هو تقديم البروتوكولات الحالية لتقييم الالتهام الذاتي في الجسم الحي في سياق الإنتان التجريبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
والميزة الرئيسية لCLP هو أنه يسمح للباحثين لتحقيق الإنتان من بالقسوة مختلفة (أي من منخفضة إلى متوسطة وعالية الجودة). يتأثر شدة الإنتان الناجم عن طول الأعور ligated (التي هي المحدد الأهم)، وحجم الإبرة المستخدمة للثقب وعدد من الثقوب يؤديها 15. بالإضافة إلى ذلك، يمك…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
Riferimenti
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
- Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
- Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
- Rivers, E., Med, s. h. o. c. k. .. N. .. E. n. g. l. .. J. .., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. 345, 1368-1377 (2001).
- Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
- Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
- Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
- Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
- Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
- Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
- Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
- Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
- Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
- Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).
