Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l'aide d'un<em> In Vitro</em> Respect de dosage
Summary
Les essais in vitro d'adhérence peuvent être utilisés pour étudier la fixation de Streptococcus pneumoniae à des monocouches de cellules épithéliales et d'enquêter sur les interventions possibles tels que l'utilisation des probiotiques pour inhiber la colonisation pneumococcique.
Abstract
L'adhésion de Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) à la épithélium du nasopharynx peut entraîner la colonisation et est considéré comme une condition préalable pour les infections à pneumocoques, comme la pneumonie et l'otite moyenne. Tests in vitro d'adhérence peuvent être utilisées pour étudier l'attachement des pneumocoques à des cellules épithéliales monocouches et d'enquêter sur les interventions possibles, comme l'utilisation de probiotiques, d'inhiber la colonisation pneumococcique. Le protocole décrit ici est utilisé pour étudier les effets de la probiotique Streptococcus salivarius sur l'adhésion des pneumocoques à la lignée cellulaire epitheliale humaine CCL-23 (parfois dénommé cellules HEp-2). L'essai comporte trois étapes principales: 1) la préparation des cellules épithéliales et bactériennes, 2) plus de bactéries épithéliales des monocouches de cellules, et 3) la détection des pneumocoques adhérent par les numérations viables (dilution en série et placage) ou quantitative PCR en temps réel (qPCR ). Cette technique est relativement simple et ne nécessite pas d'équipement spécialisé autre qu'une installation de culture de tissu. Le test peut être utilisé pour tester d'autres espèces probiotiques et / ou des inhibiteurs potentiels de la colonisation pneumococcique et peut être facilement modifié pour répondre à d'autres questions scientifiques concernant le respect pneumocoque et l'invasion.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) est une bactérie à Gram positif qui peut causer des infections comme la pneumonie, l'otite moyenne et la méningite. Il est une cause majeure de maladie chez les enfants dans les pays à faible revenu et responsables d'environ 800 000 décès d'enfants de moins de cinq ans chaque année 1. Les pneumocoques sont souvent effectuée dans le nasopharynx de jeunes enfants. Bien que cette colonisation est généralement considéré comme asymptomatique, elle précède infection pneumococcique et sert de réservoir pour les bactéries dans les populations humaines 2. Vaccination antipneumococcique conjugué réduit efficacement le transport des sérotypes contenus dans le vaccin. Cependant, il ya plus de 90 sérotypes de pneumocoques, et la vaccination peuvent conduire au remplacement de sérotype, dans lequel l'élimination des sérotypes vaccinaux est suivie par une hausse dans le transport et les maladies causées par des sérotypes non vaccinaux 3. En outre, dans certaines populations à haut risque, le pneumocoquecolonisation se produit souvent très tôt dans la vie, avant l'administration de la première dose de vaccin de 4,5. Récemment, l'utilisation de probiotiques a été proposée comme une stratégie supplémentaire pour inhiber la colonisation pneumococcique 6,7. Tests in vitro d'adhérence ont été utilisées pour examiner l'adhésion à pneumocoques 8,9. Ces essais ont été adaptés pour étudier l'impact du probiotique Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) sur l'adhésion à pneumocoques 10.
En plus de LGG et autres bactéries d'acide lactique, Streptococcus salivarius, un habitant courant de la cavité orale, a été étudiée en tant que probiotique potentiel pour les voies respiratoires en raison de son potentiel et aptitude à inhiber les pneumocoques et d'autres agents pathogènes respiratoires in vitro 11 colonisation – 13. Le protocole présenté ici décrit un essai d'adhérence utilisée pour étudier les effets de la S. salivarius K12 sur l'adhésion à pneumocoquespour la lignée de cellules épithéliales humaines CCL-23. Avant d'utiliser dans l'essai, isolats de pneumocoques ont été évalués pour les capacités d'adhérence, la croissance et les propriétés d'adhérence peuvent varier considérablement parmi les isolats 10,14. Courbes de croissance des pneumocoques et S. salivarius ont été réalisées afin de déterminer la phase semi-logarithmique et la concentration de l'estimation (unités formant des colonies ou CFU / ml) par la densité optique (DO, figure 1). Il est recommandé d'examiner la croissance en compte viable et OD pour chaque isolat avant l'utilisation dans le dosage. Ce test peut être effectué dans un laboratoire avec des équipements standard et de l'équipement de culture de tissus. Dans ce protocole, les effets de trois doses de S. salivarius administré 1 heure avant l'addition des pneumocoques sur l'adhérence de S. pneumoniae PMP843, un sérotype 19F transport isolat provenant d'un écouvillon nasopharyngé, sont examinés. Deux façons de quantifier les pneumocoques adhérent sont présentés: étalement sur gélose au sang pour dissuaderle mien comptes viables, et l'extraction de l'ADN et la détection du gène lytA pneumocoque par qPCR 15. Le protocole de l'essai d'adhérence de base peut être facilement modifié pour tester différentes doses ou le moment d'administration de probiotiques et peut également être utilisé avec d'autres souches de bactéries ou d'espèces.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une partie essentielle de ce test est d'ajouter les concentrations appropriées de S. salivarius et les pneumocoques dans les sections 3.1.7 et 3.1.12. Les concentrations sont estimées en utilisant les lectures de DO mais l'inoculum exacte ne sont pas déterminés jusqu'à plaques sont comptés le jour suivant. Pour cette raison, nous recommandons d'effectuer des courbes de croissance pour mesurer OD et les numérations viables (UFC / ml) au fil du temps pour toutes les souches bactériennes ut…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un financement du Programme opérationnel de soutien de l'infrastructure du gouvernement victorien Institut de recherche et enfants Murdoch.
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30244.01 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30084.03 | ||
| T-75 Flask | Nunc | 156472 | ||
| CCL-23 cells | ATCC | CCL-23 | ||
| Trypsin | Life Technologies | 15090046 | ||
| 24-well cell culture plate | Nunc | 142475 | ||
| Horse blood agar (HBA) plates | Oxoid | PP2001 | Sheep blood agar plates also acceptable | |
| Todd-Hewitt Broth | Oxoid | CM0189 | ||
| Yeast Extract | Beckton Dickinson | 212750 | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | ||
| Disposable cuvettes | Kartell | 1938 | ||
| Heparin | Pfizer | 2112105 | comes in sterile ampules at 5,000IU/5mL | |
| sterile spreader | Technoplas | S10805050 | alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ||
| Mutanolysin | Sigma-Aldrich | M9901 | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| SDS 20% solution | Ambion | AM9820 | ||
| RNase A | Qiagen | 19101 | ||
| QIAamp DNA mini-kit (250) | Qiagen | 51306 | ||
| LytA F primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA | |
| LytA R primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT | |
| LytA probe | Eurogentec | Custom made | 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9906 | ||
| Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix | Agilent Technologies | 600880 | ||
| Thermo-Fast 96 Detection plate | Thermo Fisher Scientific | AB-1100 | ||
| Ultra clear qPCR cap strips | Thermo Fisher Scientific | AB-0866 | ||
| Mx3005 QPCR System | Agilent Technologies | 401449 | ||
| * alternative sources are available for most/all products listed | ||||
Riferimenti
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