Summary

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em> In-vitro-</em> Einhaltung Assay

Published: April 28, 2014
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Summary

In-vitro-Assays können verwendet werden, um die Einhaltung der Befestigung von Streptococcus pneumoniae zu untersuchen, um die Zellmonoschichten epithelialen und mögliche Maßnahmen wie der Einsatz von Probiotika zur Hemmung Pneumokokken-Kolonisierung zu untersuchen.

Abstract

Anhaften von Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) an die epitheliale Auskleidung der Nasenrachenraum kann in Kolonisierung führen und wird als eine Voraussetzung für Pneumokokken-Infektionen wie Lungenentzündung und Mittelohrentzündung. In vitro Adhärenz-Assays können verwendet werden, um die Befestigung von Pneumokokken studieren zu Zelle epithelialen werden Monoschichten und mögliche Maßnahmen, wie der Einsatz von Probiotika untersuchen, um Pneumokokken-Kolonisierung zu verhindern. Das hier beschriebene Protokoll verwendet wird, um die Auswirkungen des probiotischen Streptococcus salivarius auf die Einhaltung von Pneumokokken an menschlichen Zelllinie CCL-23 zu untersuchen (manchmal als HEp-2-Zellen). Der Test besteht aus drei Stufen: 1) Vorbereitung der Epithel-und Bakterienzellen, 2) Zugabe von Bakterien epithelialen Zellmonoschichten, und 3) Detektion von anhaftenden Pneumokokken durch Keimzahl (serielle Verdünnung und Beschichtung) oder quantitative Echtzeit-PCR (qPCR ). Diese technique ist relativ einfach und keine Spezialgeräte außer einer Gewebekultur-Setup benötigen. Der Test kann verwendet werden, um andere probiotische Spezies und / oder potentiellen Inhibitoren der Pneumokokken-Kolonisation zu testen und können leicht geändert werden, um andere wissenschaftliche Fragen zur Pneumokokken-Adhärenz und Invasion zu adressieren.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) ist ein Gram-positive Bakterien, die Infektionen, einschließlich Lungenentzündung, Mittelohrentzündung und Hirnhautentzündung führen kann. Es ist eine der Hauptursachen der Erkrankung bei Kindern in Ländern mit niedrigem Einkommen und für geschätzte 800.000 Todesfälle von Kindern unter fünf Jahren jährlich 1 verantwortlich. Pneumokokken sind häufig in den Nasenrachenraum von Kindern durchgeführt. Obwohl dieser Kolonisation ist allgemein als asymptomatisch, sie Pneumokokkeninfektion voran und dient als Reservoir für die Bakterien in menschlichen Populationen 2. Pneumokokken-Konjugat-Impfung verringert effektiv die Beförderung der im Impfstoff enthaltenen Serotypen. Allerdings gibt es über 90 Pneumokokken-Serotypen, und die Impfung kann Serotyp Ersatz, wobei die Beseitigung der Impfstoff-Serotypen wird von einem Anstieg der Wagen und Krankheit, die durch nonvaccine Serotypen 3 verursacht, gefolgt führen. Auch in einigen Hochrisikogruppen, PneumokokkenKolonisierung tritt oft sehr früh im Leben, vor der Verabreichung der ersten Impfstoffdosis 4,5. Kürzlich wurde die Verwendung von Probiotika als zusätzliche Strategie, um Pneumokokken-Kolonisierung 6,7 hemmen, vorgeschlagen. In vitro Adhärenz-Assays wurden verwendet, um Pneumokokken Einhaltung 8,9 untersuchen. Diese Tests wurden angepasst, um die Auswirkungen des probiotischen Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) auf die Einhaltung Pneumokokken 10 zu untersuchen.

Zusätzlich zu LGG und anderen Milchsäurebakterien, Streptococcus salivarius, eine gemeinsame Bewohner der Mundhöhle, wurde als potenzielle Probiotikum für die Atemwege aufgrund seiner Besiedelung Potential und die Fähigkeit, Pneumokokken und anderen respiratorischen Pathogenen in vitro hemmen, untersucht 11 – 13. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt ein Festhalten Assay verwendet, um die Effekte von S. untersuchen salivarius K12 auf Pneumokokken-Einhaltungauf den menschlichen Zelllinie CCL-23. Vor der Verwendung im Test wurden die Pneumokokken-Isolate für die Einhaltung Fähigkeiten ausgewertet, da Wachstum und Hafteigenschaften kann im Wesentlichen zwischen den Isolaten 10,14 variieren. Wachstumskurven von Pneumokokken und S. salivarius geführt wurden bis zur mittleren log-Phase und Schätzung Konzentration (koloniebildende Einheiten oder CFU / ml) durch die optische Dichte zu bestimmen (OD, Fig. 1). Es wird empfohlen, das Wachstum von Keimzahl und OD untersuchen für jedes Isolat vor der Verwendung im Test. Dieser Test kann in jedem Labor mit Standardgewebekultureinrichtungen und Anlagen durchgeführt werden. In diesem Protokoll werden die Wirkungen von drei Dosen von S. salivarius, verabreicht 1 Stunde vor der Zugabe von Pneumokokken auf die Einhaltung von S. pneumoniae PMP843 ein Serotyp 19F Wagen Isolat aus einem Nasen-Rachen-Abstrich gewonnen werden, untersucht. Zwei verschiedene Wege, um anhaftende Pneumokokken quantifizieren vorgestellt: Plattierung auf Blut-Agar zur AbschreckungMine Keimzahl und DNA-Extraktion und Nachweis von Pneumokokken lytA Gens durch qPCR 15. Die Grund Einhaltung Assayprotokoll können leicht modifiziert werden, um verschiedene Dosen oder Zeit der Verabreichung von Probiotika testen und kann auch mit anderen bakteriellen Stämmen oder Spezies verwendet werden.

Protocol

1. Vorbereitung der Epithelial-und Bakterienzellen Auftauen von CCL-23 Epithelzellen Vorwärmen Minimum Essential Medium (MEM), enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS) in einem 37 ° C Wasserbad für ~ 30 min. Sterilisieren Sie die Gewebekultur-zugelassenen biologischen Sicherheitsschrank mit UV-Licht für mindestens 10 min vor der Verwendung, und wischen Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Flasche erwärmt Medien mit 70% Ethanol und in Biosicherheitsw…

Representative Results

Ergebnisse eines repräsentativen Experiments, bei dem Pneumokokken (S. pneumoniae PMP843 eine Kolonisierung 19F Isolat) wurden in CCL-23-Zellen 1 h nach der Zugabe von S. hinzugefügt salivarius und Pneumokokken-Adhärenz wurde sowohl Keimzahl und lytA qPCR quantifiziert werden in Tabelle 2 gezeigt. Ergebnisse waren konsistent zwischen den beiden Methoden für sowohl die absolute Anzahl von Bakterien (wie CFU / ml dargestellt) und die Einhaltung%, normiert auf die An…

Discussion

Ein wichtiger Teil dieses Assays wird um die entsprechende Konzentrationen von S. salivarius und Pneumokokken in den Abschnitten 3.1.7 und 3.1.12. Die Konzentrationen werden mit OD-Werten geschätzt, aber die genaue Inokula sind nicht bestimmt, bis Platten gezählt werden am folgenden Tag. Aus diesem Grund empfehlen wir die Durchführung von Wachstumskurven auf OD und Keimzahl (CFU / ml) über die Zeit für alle Bakterienstämme im Assay verwendet, um den mittleren log-Phase zu identifizieren und helfen bei der…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Murdoch Childrens Research Institute und betriebliche Infrastruktur-Support-Programm der Regierung von Victoria unterstützt.

Materials

Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03
T-75 Flask Nunc 156472
CCL-23 cells ATCC CCL-23
Trypsin Life Technologies 15090046
24-well cell culture plate Nunc 142475
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG
Disposable cuvettes Kartell 1938
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000IU/5mL
sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901
Proteinase K Qiagen 19133
SDS 20% solution Ambion AM9820
RNase A Qiagen 19101
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880
Thermo-Fast 96 Detection plate Thermo Fisher Scientific AB-1100
Ultra clear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449
* alternative sources are available for most/all products listed

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

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