Новый подход к сравнительному анализу мультибелковых комплексов на основе<sup> 15</sup> N Метаболический Маркировка и количественный Масс-спектрометрия
Summary
Описанный сравнительный количественный протеомических подход направлен на получение представление в состав мультибелковых комплексов при различных условиях и продемонстрировано сравнением генетически различных штаммов. Для количественного анализа равные объемы различных фракций с градиентом плотности сахарозы, смешивают и анализировали с помощью масс-спектрометрии.
Abstract
Введенный протокол предоставляет инструмент для анализа мультибелковых комплексов в тилакоидной мембраны, путем выявления понимание сложного состава в различных условиях. В этом протоколе подход продемонстрирована сравнением состав белкового комплекса, отвечающего за циклического потока электронов (CEF) в Chlamydomonas reinhardtii, изолированного от генетически различных штаммов. Процедура включает в себя изоляцию тилакоидных мембран, после чего их разделения на мультибелковых комплексов в градиенте плотности сахарозы центрифугирования, SDS-PAGE, иммунологического и сравнительного, количественного масс-спектрометрии (МС) на основе дифференциального метаболического маркировки (14 Н / 15 п) проанализированные штаммы. Моющие солюбилизированные тилакоидные мембраны загружаются на градиентах плотности сахарозы при равной концентрации хлорофилла. После ультрацентрифугированием, градиенты разделены на фракции, которые проанализированы масс-spectrometры на основе равного объема. Такой подход позволяет исследование состава в градиентных фракций и, кроме того, чтобы проанализировать миграционного поведения различных белков, который специально разработан для ANR1, CAS, и PGRL1. Кроме того, этот метод продемонстрировано подтверждает результаты иммуноблоттинга с и, кроме того, поддерживая выводы из предыдущих исследований (идентификации и PSI-зависимой миграции белков, которые были ранее описанных быть частью CEF-суперсложные таких как PGRL1, FNR, и цит е). Примечательно, что этот подход применим для решения широкого круга вопросов, для которых этот протокол могут быть приняты и, например, используемых для сравнительного анализа мультибелкового сложного состава, выделенного из различных условиях окружающей среды.
Introduction
Фотосинтетические процессы в тилакоидных мембран растений и водорослей может функционировать в линейном и циклическом режиме. Во линейного электронного потока (LEF) фотосистемы I (PSI), фотосистемы II (ФС) и цитохром б 6 / F в конечном счете переноса электронов от воды к НАДФ + 1, что приводит к генерации НАДФН и АТФ 2. В противоположность этому, циклический поток электронов (CEF), который, как известно, индуцированный в разнообразных условиях окружающей среды, таких как состояние 2 3 и 4 анаэробных условиях, приводит к уменьшению повторного окисленного PSI инжекцией электронов обратно в цепи транспорта электронов. Этот процесс может происходить либо в стромальных стороне цитохрома Ь 6 / ж комплекса 1 или на пластохинона бассейн 5 и генерирует АТФ, но не НАДФН 2.
Целью представленного протокола является продемонстрировать масс-спектрометрии (MS) на основе меню для сравнительного, количественного анализа мультибелковых комплексов в мембранах тилакоидов из Chlamydomonas reinhardtii, чтобы разобраться в состав этих комплексов в различных условиях (на примере сравнения генетически различных штаммов). Этот подход был применен в публикации Terashima и соавт. В 2012 показывая Ca 2 +-зависимый регулирование CEF в С. reinhardtii посредничестве мультибелкового комплекса, включающего белков CAS, ANR1 и PGRL1 6. Процедура будет объяснено сравнительно анализа состава в CEF-суперсложные в двух генетически различных штаммов, тем самым воспользовавшись маркировки один из двух штаммов с тяжелой азота (N) 15. Вкратце, протокол включает в себя подготовку мембран тилакоидов, а затем моющего растворения и фракционирования фотосинтезирующих комплексов в градиентом плотности сахарозы. После фракционирования градиента, выбранный гидроразрываций двух штаммов смешивают на основе равного объема, разделенных электрофорезом в ДСН-ПААГ с последующим в геле пищеварения и последующего количественного анализа MS.
Как упоминалось выше, CEF индуцируется в различных экологических условиях и публикация с 2010 демонстрирует изоляцию функциональной CEF-сверхсложных от государства 2 заблокированные клетки C. reinhardtii 7, который был выполнен путем разделения растворенные тилакоидных мембран на градиент плотности сахарозы в течение ультрацентрифугирования. В отличие от Иваи и соавт. 7, представленный протокол описывает изоляцию CEF-сверхсложных от анаэробной выращенного С. reinhardtii культуры, следуя альтернативную процедуру. Это включает в себя изменения в протокол изоляции тилакоидной а также различия в отношении стадии солюбилизации и разделение белковых комплексов посредством ультрацентрифугирования. В настоящем Протоколе, тилакоидные мембраныизолированы с помощью процедуры, опубликованный Чуа и Bennoun 8, в то время как буферы используются для тилакоидной подготовки по Иваи и др.. содержится 25 мМ MES, 0,33 М сахарозы, 5 мм MgCl 2, 1,5 мМ NaCl (рН 6,5), как описано 9. Растворение проводили с 0,7-0,8% моющего средства (н-тридецил-β-D-мальтозид) в течение 30 мин на льду в случае Iwai с соавторами, а метод солюбилизации описано здесь основана на использовании 0,9% моющего средства (п -додецил-β-D-мальтозид (β-DM)) и выполняется в течение только 20 минут на льду. Обе группы использовали 0,8 мг на мл хлорофилла для солюбилизации с соответствующим моющим средством. Для разделения фотосинтезирующих комплексов от растворенных мембран тилакоидов Иваи и др.. Применяется концентрации сахарозы между 0.1-1.3 M, в то время как авторы этого протокола используется концентрациях от 0,4-1,3 М. последняя разность скорость центрифугирования, что ниже по сравнению к еаrlier публикации.
Солюбилизация мембран тилакоидов с неионогенных моющих средств с последующим градиент плотности сахарозы фракционирования уже применяется в многочисленных исследованиях не начиная с 1980-х до сегодняшнего дня 7, 9-14, а также применение метаболического маркировки белков является распространенным методом в области протеомики. Описанный подход применяет 15 N метаболизма маркировки для одного из двух сравниваемых штаммов при культивировании ее в присутствии тяжелого азота в качестве единственного источника азота в виде 15 N NH 4 Cl, который включен во все аминокислоты, ведущих к массе сдвиг в зависимости от аминокислотной последовательности пептида. При анализе смесь 14 N и 15 Н в течение одного MS работать, этот сдвиг массы могут быть использованы для определения образца происхождение для каждого пептида и пептида относительной распространенности можно рассчитать относительное содержание представляющий для соответствуютING белок 15.
Многочисленные количественные протеомики исследования по С. reinhardtii доступны, которые сравнивают определенное количество белка для анализа изменений в протеоме между экспериментальных условиях (например, изменения в протеоме из-за питательной 16-19 или светло стресса 20,21). По сравнению с теми исследований, в настоящее время, представленного подхода равные объемы образцов объединены и проанализированы. Эта установка позволяет изучить поведение миграции белков внутри градиента и, кроме того, чтобы проанализировать состав различных комплексов по отношению к исследованных штаммов.
Этот метод будет объясняется главным образом сосредоточиться на трех белков: Первым кандидатом является кальций белка датчик CAS хлоропластов локализованные, который был показан принять участие в фото-акклиматизации в С. reinhardtii 22. Кальций считается важным сигналомING ион для путей, которые активируются в силу различных биотических и абиотических стрессов, наконец, приводит к изменениям в экспрессии генов и клеточной физиологии 23, и было предложено, что хлоропласты могут способствовать сотовой Са 2 + сигналов посредством белка CAS 22,24,25. Второй белок ANR1 (анаэробная реакция 1 6), белок, который был показан быть вызван в бескислородных условиях выращивания в С. reinhardtii 26. В частности, CAS а также ANR1 были идентифицированы как субъединиц CEF-суперсложные и кроме того, с помощью обратного генетические подходы, было показано, что оба белка способствовать функционально CEF в естественных условиях 6, поддерживая их роли в качестве функциональных субъединиц этого белкового комплекса. Третий белок тилакоидной белок PGR5-Как 1 (PGRL1), который был показан принять участие в CEF в хламидомонады 4,27, а также в Arabidopsis 5,28 и был также идентификаторentified в работе Иваи и соавт. 7
Этот подход будет представлен, показывающий результаты двух разных экспериментов: дикого типа (WT) по сравнению с (по сравнению) штамм ΔPSI 29, демонстрируя делецию гена psab, кодирующую существенной фотосистемы I-субъединицы, которая также является частью CEF-сверхсложные и WT против pgrl1 нокаут нагрузку 4. Для каждого из этих экспериментов количественный состав CEF-суперсложные между 15 и N-14 N-меченого штамм был по сравнению.
Protocol
Representative Results
Discussion
Различные количественные протеомные исследования с использованием стабильным изотопом маркировки были опубликованы в последние годы. В этих экспериментах обычно два различных образцов сравниваются, из которых один образец помечен стабильного изотопа. После этого белки или пептиды …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MH признает поддержку от "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). Автор взносы: MH предназначены исследований; KT, JS и МТ проведенных исследований и проанализировали данные; КТ и MH написал статью.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0662 | |
| Acetone | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2300 | |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
9340 | harmful, work with gloves see protocol text for further precautions |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories website: http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
39466-62-1 | |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0988 | |
| Ammonium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3583 | |
| Ammonium sulfate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3598 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific website: http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
10041653 | |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0819 | |
| EDTA | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2937 | |
| Formic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3858 | |
| Hepes | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3724 | |
| Magnesium chloride | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A4425 | |
| Methanol | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2954 | |
| Phosphorous acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0989 | |
| Di-Potassium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1042 | |
| Potassium di-hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1043 | |
| Sodium hydroxide | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1551 | |
| Sucrose | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1125 | |
| Tricine | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3954 | |
| Tris | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2264 | |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega website: http://www.promega.de/ |
V5111 | |
| Equipment | |||
| Neboulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col website: http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 |
||
| Centrifuge tubes (14 x 89 mm) for preparation of takahashi style gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
331372 | |
| Centrifuge tubes 25 x 89 mm for preparation of thylakoid isolation gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
344058 | |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
449/72 | |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
10618242 | |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
105252220 | |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| Altro | |||
| Antibodies | Agrisera website: http://www.agrisera.com/en/index.html |
Riferimenti
- Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
- Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
- Finazzi, G., Furia, A., Barbagallo, R. P., Forti, G. State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 1413 (3), 117-129 (1999).
- Tolleter, D., et al. Control of hydrogen photoproduction by the proton gradient generated by cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (7), 2619-2630 (2011).
- Hertle, A. P., et al. PGRL1 Is the Elusive Ferredoxin-Plastoquinone Reductase in Photosynthetic Cyclic Electron Flow. Mol. Cell. 49 (3), 511-523 (2013).
- Terashima, M., et al. Calcium-dependent regulation of cyclic photosynthetic electron transfer by a CAS, ANR1, and PGRL1 complex. PNAS. 109 (43), 17717-17722 (2012).
- Iwai, M., Takizawa, K., Tokutsu, R., Okamuro, A., Takahashi, Y., Minagawa, J. Isolation of the elusive supercomplex that drives cyclic electron flow in photosynthesis. Nature. 464 (7292), 1210-1213 (2010).
- Chua, N. H., Bennoun, P. Thylakoid Membrane Polypeptides of Chlamydomonas reinhardtii: Wild-Type and Mutant Strains Deficient in Photosystem II Reaction Center. PNAS. 72 (6), 2175-2179 (1975).
- Takahashi, H., Iwai, M., Takahashi, Y., Minagawa, J. Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. PNAS. 103 (2), 477-482 (2006).
- Ikeuchi, M., Plumley, F. G., Inoue, Y., Schmidt, G. W. Phosphorylation of Photosystem II Components, CP43 Apoprotein, D1, D2, and 10 to 11 Kilodalton Protein in Chloroplast Thylakoids of Higher Plants. Plant Physiol. 85 (3), 638-642 (1987).
- Ruban, A. V., Lee, P. J., Wentworth, M., Young, A. J., Horton, P. Determination of the Stoichiometry and Strength of Binding of Xanthophylls to the Photosystem II Light Harvesting Complexes. J. Biol. Chem. 274 (15), 10458-10465 (1999).
- Barera, S., Pagliano, C., Pape, T., Saracco, G., Barber, J. Characterization of PSII-LHCII supercomplexes isolated from pea thylakoid membrane by one-step treatment with α- and β-dodecyl-D-maltoside. Phil. Trans. R. Soc. B. 367 (1608), 3389-3399 (2012).
- Kantzilakis, K., et al. A comparative approach towards thylakoid membrane proteome analysis of unicellular green alga Scenedesmus obliquus. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (9), 2271-2279 (2007).
- Takahashi, Y., Yasui, T., Stauber, E. J., Hippler, M. Comparison of the subunit compositions of the PSI-LHCI supercomplex and the LHCI in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica. 43 (24), 7816-7823 (2004).
- Thelen, J. J., Peck, S. C. Quantitative proteomics in plants: choices in abundance. Plant Cell. 19 (11), 3339-3346 (2007).
- Hsieh, S., et al. The Proteome of Copper, Iron, Zinc, and Manganese Micronutrient Deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteom. 12 (1), 65-86 (2013).
- Longworth, J., Noirel, J., Pandhal, J., Wright, P. C., Vaidyanathan, S. HILIC- and SCX-based quantitative proteomics of Chlamydomonas reinhardtii during nitrogen starvation induced lipid and carbohydrate accumulation. J. Proteome Res. 11 (12), 5959-5971 (2012).
- Malasarn, D., et al. Zinc deficiency impacts CO2 assimilation and disrupts copper homeostasis in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 288 (15), 10672-10683 (2013).
- Höhner, R., et al. The metabolic status drives acclimation of iron deficieny responses in Chlamydomonas reinhardtii as revealed by proteomics based hierarchical clustering and reverse genetics. Mol. Cell. , (2013).
- Mahong, B., Roytrakul, S., Phaonaklop, N., Wongratana, J., Yokthongwattana, K. Proteomic analysis of a model unicellular green alga, Chlamydomonas reinhardtii, during short-term exposure to irradiance stress reveals significant down regulation of several heat-shock proteins. Planta. 235 (3), 499-511 (2012).
- Förster, B., Mathesius, U., Pogson, B. J. Comparative proteomics of high light stress in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 6 (15), 4309-4320 (2006).
- Petroutsos, D., et al. The chloroplast calcium sensor CAS is required for photoacclimation in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (8), 2950-2963 (2011).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Nomura, H., Komori, T., Kobori, M., Nakahira, Y., Shiina, T. Evidence for chloroplast control of external Ca2+-induced cytosolic Ca2+ transients and stomatal closure. Plant J. 53 (6), 988-998 (2008).
- Weinl, S., et al. A plastid protein crucial for Ca2+-regulated stomatal responses. New Phytol. 179 (3), 675-686 (2008).
- Terashima, M., Specht, M., Naumann, B., Hippler, M. Characterizing the anaerobic response of Chlamydomonas reinhardtii by quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (7), 1514-1532 (2010).
- Petroutsos, D., et al. PGRL1 participates in iron-induced remodeling of the photosynthetic apparatus and in energy metabolism in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 284 (47), 32770-32781 (2009).
- DalCorso, G., et al. A complex containing PGRL1 and PGR5 is involved in the switch between linear and cyclic electron flow in Arabidopsis. Cell. 132 (2), 273-285 (2008).
- Redding, K., et al. A systematic survey of conserved histidines in the core subunits of Photosystem I by site-directed mutagenesis reveals the likely axial ligands of P700. EMBO J. 17 (1), 50-60 (1998).
- Harris, E. H. . The Chlamydomonas Sourcebook. Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. , (2008).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975 (3), 384-394 (1989).
- Naumann, B., Stauber, E. J., Busch, A., Sommer, F., Hippler, M. N-terminal processing of Lhca3 Is a key step in remodeling of the photosystem I-light-harvesting complex under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 280 (21), 20431-20441 (2005).
- Hippler, M., Klein, J., Fink, a., Allinger, T., Hoerth, P. Towards functional proteomics of membrane protein complexes: analysis of thylakoid membranes from Chlamydomonas reinhardtii. Plant J. 28 (5), 595-606 (2001).
- Naumann, B., et al. Comparative quantitative proteomics to investigate the remodeling of bioenergetic pathways under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 7 (21), 3964-3979 (2007).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Prot. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Specht, M., Kuhlgert, S., Fufezan, C., Hippler, M. Proteomics to go: Proteomatic enables the user-friendly creation of versatile MS/MS data evaluation workflows. Bioinformatics. 27 (8), 1183-1184 (2011).
- Geer, L. Y., et al. Open mass spectrometry search algorithm. J. Proteome Res. 3 (5), 958-964 (2004).
- Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat. Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Käll, L., Storey, J. D., Noble, W. S. QVALITY: non-parametric estimation of q-values and posterior error probabilities. Bioinformatics. 25 (7), 964-966 (2009).
- Wollman, F. A., Bennoun, P. A new chlorophyll-protein complex related to photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 680, 352-360 (1982).
- Bailey, S., et al. A critical role for the Var2 FtsH homologue of Arabidopsis thaliana in the photosystem II repair cycle in vivo. J. Biol. Chem. 277 (3), 2006-2011 (2002).
- Kato, Y., Sakamoto, W. Protein quality control in chloroplasts: a current model of D1 protein degradation in the photosystem II repair cycle. J. Biochem. 146 (4), 463-469 (2009).
- Meurer, J., Plücken, H., Kowallik, K. V., Westhoff, P. A nuclear-encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. EMBO J. 17 (18), 5286-5297 (1998).
- Kuras, R., Wollman, F. A. The assembly of cytochrome b6/f complexes: an approach using genetic transformation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J. 13 (5), 1019-1027 (1994).
- de Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F., Kallas, T. Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell. 11 (10), 2031-2044 (1999).
- Hamel, P., Olive, J., Pierre, Y., Wollman, F. A., de Vitry, C. A new subunit of cytochrome b6f complex undergoes reversible phosphorylation upon state transition. J. Biol. Chem. 275 (22), 17072-17079 (2000).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent-resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8 (9), 2186-2198 (2009).
- Atteia, A., et al. A proteomic survey of Chlamydomonas reinhardtii mitochondria sheds new light on the metabolic plasticity of the organelle and on the nature of the alpha-proteobacterial mitochondrial ancestor. Mol. Biol. Evol. 26 (7), 1533-1548 (2009).
- Pagliano, C., Barera, S., Chimirri, F., Saracco, G., Barber, J. Comparison of the α and β isomeric forms of the detergent n-dodecyl-D-maltoside for solubilizing photosynthetic complexes from pea thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1817 (8), 1506-1515 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6 (5), 3-7 (2009).
