Рассечение<em> Xenopus Laevis</em> Нервного гребня для<em> В пробирке</em> Эксплантата Культура или<em> В естественных условиях</em> Трансплантация
Summary
Этот протокол описывает, как препарировать премиграторных черепной нервный гребень (NC) от Xenopus Laevis neurulas. Эти экспланты можно покрыть на фибронектине и культивировали в пробирке, или привиты обратно в эмбрионы хозяев. Этот метод позволяет изучать механизмы НК эпителий-в-мезенхимы перехода, миграции и дифференциации.
Abstract
Нервного гребня (NC) является переходным население спинной нервной трубки клетка, которая подвергается переход эпителий-в-мезенхимы (EMT) в конце нейруляции, мигрирует широко к различным органам и дифференцируется в многих видов производных (нейроны, глиальные, хрящи и кости, пигментные и эндокринные клетки). В этом протоколе, мы опишем, как рассекают премиграторных черепной NC из эмбрионов Laevis Xenopus, с целью изучения развития NC в естественных условиях и в пробирке. Лягушка модель имеет много преимуществ для изучения раннего развития; обильные партии имеются, эмбрионы развиваются быстро, в естественных условиях усиления и потеря стратегий функциональных позволяют манипуляции экспрессии генов до NC вскрытия в донора и / или эмбрионов хозяев. Эксплантаты NC можно покрыть на фибронектине и используется для исследований в пробирке. Они могут быть культивированы в течение нескольких дней в бессывороточной среде. Мы также описать, как привить ЧПУ эксплантов назадв эмбрионы принимающих для изучения NC миграцию и дифференцировку в естественных условиях.
Introduction
Нервного гребня (NC) является переходным эмбриональных клеточная популяция, которая возникает из нервной трубки в конце нейруляции у эмбрионов позвоночных. События сигнализации и генетические, которые контролируют спецификации NC начаться уже в гаструляции. NC задается на границе между нервной и не-нейральной эктодермы по сигналам от окружающих спинной тканей. В конце нейруляции, NC клетки пройти переход эпителий-в-мезенхимы (EMT) и мигрируют широко в зародыше следующее стереотипных маршрутов, отвечая на окружающих руководящие сигналы. После того, как они достигли своего конечного пункта назначения, они дифференцируются в широкий спектр производных, например нейронов, глии, кости, хрящи и пигментных клеток 1-5. Из-за их вклад в многих типах клеток и эмбриональных тканей, дефектов на любом этапе НК развития клеток, от индукции до конечной дифференциации, может вызвать врожденные синдромы названные neurocristopathies 6. Experimental манипуляции с развивающейся NC на разных стадиях – Спецификация, ЕМТ, миграции и дифференцировки – улучшит наше понимание neurocristopathies и позволяют дизайн потенциальных терапевтических стратегий.
Xenopus Laevis эмбрион является моделью выбора для изучения развития ЧПУ. Большое количество эмбрионов легко получить, и внешний оплодотворение дает доступ к самых первых шагов развития. Многие инструменты доступны для экспериментально манипулировать X. Laevis эмбрионального развития. Джин усиления из-функции и нокдаун легко выполнить с помощью microinjecting отдельные клетки ранних Бластулы. Эмбриональные ткани можно вырезать для реассоциации в пробирке 7-11 или обратно-прививки анализов 12,13.
В этом протоколе, мы опишем, как рассекать из премиграторных черепной NC в X. Laevis поздно neurulas, до миграции. Эти экспланты можно культивировать на фибронектина-Coateд пластины для изучения миграции и дифференциации в контролируемых в пробирке экспериментальных условиях. NC экспланты также могут быть привиты в нормальных или манипулировать эмбрионов принимающих изучать их миграции и дифференциации в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает простой метод для эксплантата премиграторных черепной NC в эмбрионах Laevis X.. Эмбрионы, используемые для таких экспериментов должны быть надежными и заживают. Отменить любые партию нездоровых эмбрионов. Кроме того, эмбрионы растут при различных температурах…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Adeline Долли для картин эксплантата на фибронектина, Эрик Theveneau за полезные обсуждения и вивария Института Кюри. CM является докторской парень из области Иль-де-Франс (Domaine d'intérêt Majeur стволовых полюс), Universite Paris Sud (атташе Temporaire d'Enseignement др. де Recherche) и Национальное агентство по де-ла-Recherche. Эта работа финансировалась по Universite Paris Sud (Attractivite 2011), Национального центра де-ла-Научных Исследований (Программа действий Thematique ET Incitative сюр), Ассоциации залить ла Recherche Контр ле Рак Грант SFI20101201882, Лига Контр ле Рак, и Национальное агентство по Recherche (Agence Nationale-де-ла Recherche Программа Блан).
Materials
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F4759-1MG | |
| Bovine Serum Albumine. Fraction V | Euromedex | 04-100-811-C | Lower quality grade may be suitable for this application |
| Stainless Steel Insect Pins. Size 000 | FST | 26001 | |
| Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm | FST | 11252-20 |
Riferimenti
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).
- Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction. Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates. Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).
- Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos. Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).
- Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. Molecular Bases of Human Neurocristopathies. Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).
- Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization. J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).
- Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation. J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).
- Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction. Cell. 50 (5), 749-758 (1987).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
- Monsoro-Burq, A. -. H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).
- Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy. Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).
- Theveneau, E., et al. Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).
- Slack, J. M., Forman, D. An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).
- Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin. Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).
- Fort, P., et al. Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration. Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
- Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases. Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).
- Hwang, Y. -. S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs.. Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).
- Shnitsar, I., Borchers, A. PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration. Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
- Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. Wnt11r is required for cranial neural crest migration. Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).
- Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2. Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).
- Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration. Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).
- Borchers, A., David, R., Wedlich, D. Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification. Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).
- Borchers, A., Epperlein, H. -. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).
- Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues. Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).
