Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas
Summary
Se describe un método para etiquetar proteína en la superficie de neuronas vivas usando un anticuerpo policlonal específico para epítopos extracelulares. La proteína unida por el anticuerpo en la superficie celular y, posteriormente, internalizado a través de la endocitosis se puede distinguir de la proteína restante en, o de trata a, la superficie durante la incubación.
Abstract
Con el fin de demostrar la localización de la superficie celular de un receptor transmembrana putativo en neuronas cultivadas, etiquetamos la proteína en la superficie de las neuronas en vivo con un anticuerpo primario específico generado contra una porción extracelular de la proteína. Dado que los receptores son objeto de tráfico hacia y desde la superficie, si las células se permeabilizaron después de la fijación a continuación, tanto de la superficie celular y la proteína interna serán detectados por el mismo anticuerpo secundario marcado. Aquí, hemos adaptado un método utilizado para estudiar el tráfico de proteínas ("alimentación anticuerpo") diferencialmente proteína etiqueta que había sido internalizado por endocitosis, durante la etapa de incubación de anticuerpos y proteínas que, o bien se quedaron en la superficie de la célula o se trafica a la superficie durante este periodo . La capacidad de distinguir estos dos grupos de proteínas fue posible gracias a la incorporación de un paso de bloqueo durante la noche con el anticuerpo secundario marcado altamente concentrado-después de una incubatio inicialn de las neuronas unpermeabilized con un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente-. Después de la etapa de bloqueo, la permeabilización de las neuronas permitió la detección de la piscina interiorizado con un anticuerpo secundario fluorescente marcada con un fluoróforo diferente. Usando esta técnica pudimos obtener información importante acerca de la localización subcelular de este receptor putativo, revelando que era, de hecho, víctimas de la trata a la superficie celular en las neuronas. Esta técnica es ampliamente aplicable a una gama de tipos de células y proteínas de la superficie celular, proporcionando un anticuerpo adecuado a un epítopo extracelular está disponible.
Introduction
En el establecimiento de la función de las proteínas recientemente identificadas, la investigación de la localización subcelular y el tráfico de la proteína en cuestión puede proporcionar importantes pistas sobre el probable rol / s del 1,2 proteínas. El análisis bioinformático del transcriptoma del neocórtex en desarrollo 3 nos proporcionó una lista de genes que muestran expresión alterada durante ratón corticogenesis cerebro. Adoptamos entonces un enfoque knockout de genes para determinar que la proteína codificada por uno de estos genes, sez6, tiene un papel clave en el desarrollo de las neuronas. Hemos observado que el gen relacionado con la incautación-6, o Sez6, la proteína se encuentra en las dendritas en desarrollo y también está presente en las espinas dendríticas, estructuras especializadas en las dendritas que reciben e integran señales excitadoras. Además, cuando esta proteína es deficiente, las dendritas y las sinapsis excitadoras no se forman correctamente 4. La isoforma dominante probable de la proteína tiene características de un transmembranreceptor de correo aunque, cuando la distribución subcelular de la proteína inmunomarcadas se examinó por microscopía confocal o microscopía inmunoelectrónica por la mayoría, si no todos, de la señal aparecido asociada con vesículas pequeñas en el compartimiento somatodendrítico con poco, o ningún, proteína marcada en la membrana plasmática en la superficie celular.
Con el fin de mostrar definitivamente que este receptor putativo con un gran dominio extracelular predicho es objeto de tráfico a la membrana plasmática, se adoptó un enfoque de células vivas utilizando el antisuero que habíamos generada a una porción extracelular de la proteína para etiquetar proteínas en la superficie celular. Al combinar este enfoque "anticuerpo de alimentación" con dos aplicaciones de anticuerpo secundario marcado con diferencialmente separados por una extensa etapa de bloqueo y un paso de permeabilización, pudimos identificar dos piscinas diferentes de proteínas que se distinguen por su unión a anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia que soportan diferentes colgetiquetas rentes. Por lo tanto, hemos sido capaces de distinguir las proteínas que habían sido internalizados por endocitosis, durante la etapa de incubación de anticuerpos de la proteína que, o bien se quedaron en la superficie de la célula o se trafica a la superficie durante este período. Usando este método, se estableció que la proteína de interés es objeto de tráfico hacia y desde la superficie celular en las neuronas. Por lo tanto, esta técnica relativamente rápido y simple resultó más informativo que los métodos tradicionales de inmunocitoquímica o pre-incrustación de microscopía electrónica por inmunomarcaje, a pesar del hecho de que se utilizó el mismo antisuero policlonal de conejo para todas estas técnicas. Esta técnica es aplicable en general a cualquier proteína transmembrana proporcionado un buen anticuerpo que reconoce epítopos dominio extracelular está disponible. La técnica se ha usado previamente para estudiar el tráfico del receptor de la subunidad GluR1 del receptor de glutamato 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica descrita aquí es complementaria a la de la biotinilación de la superficie celular (revisado por Arancibia-Carcamo et al.) 12 y es el método de elección para la preservación de la información sobre la localización subcelular de la proteína internalizada, proporcionado un anticuerpo primario adecuado a una epítopo extracelular está disponible. Además, la cuantificación de tráfico de proteínas / internalización en el tiempo se puede realizar (mediante la fijación de cubreobje…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Teele Palumaa para obtener ayuda con las figuras. Financiado por el Proyecto de Grant 1008046 de la National Health and Medical Research Council, Australia.
Materials
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC – handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen – Molecular Probes | A21206 |
Riferimenti
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