Preparação de Segmentadas Microtubules para estudar Moções impulsionado pela desmontagem de microtúbulos Termina

Summary

Os microtúbulos são inerentemente instáveis ​​polímeros, e sua alternância entre crescimento e redução é estocástico e difícil de controlar. Aqui nós descrevemos protocolos utilizando microtúbulos segmentados com tampas de estabilização photoablatable. Despolimerização dos microtúbulos segmentados pode ser acionado com alta resolução temporal e espacial, ajudando assim a análise de movimentos com a desmontagem extremidades dos microtúbulos.

Abstract

Microtubule despolimerização pode fornecer força para o transporte de diferentes complexos de proteínas e pérolas revestidas de proteínas in vitro. Os mecanismos subjacentes são pensados ​​para jogar um papel vital nos movimentos do cromossoma dependente de microtúbulos durante a divisão celular, mas as proteínas relevantes e suas funções exatas são mal definido. Assim, existe uma necessidade crescente de desenvolver ensaios com a qual para estudar tal motilidade in vitro, utilizando os componentes purificados e meio bioquímico definido. Os microtúbulos, no entanto, são intrinsecamente instáveis ​​polímeros, a sua comutação entre crescimento e encurtamento é estocástica e difícil de controlar. Os protocolos que descrevemos aqui aproveitar os microtúbulos segmentados que são feitos com o photoablatable estabilização caps. Despolimerização desses microtúbulos segmentados podem ser acionados com alta resolução temporal e espacial, ajudando assim os estudos de mobilidade nas extremidades desmontagem dos microtúbulos. Esta técnica pode ser usada para carry a uma análise quantitativa do número de moléculas em complexos de proteína fluorescente marcado, que se movem com processively dinâmica dos microtúbulos termina. Para optimizar a relação de sinal-para-ruído neste e em outros ensaios fluorescentes quantitativos, lamelas devem ser tratadas para reduzir a absorção não específica de proteínas marcadas fluorescentemente-solúveis. Protocolos detalhados são fornecidos para ter em conta as irregularidades de iluminação fluorescente, e determinar a intensidade de um único fluoróforo usando ajuste de Gauss equidistante. Finalmente, descreve-se o uso de microtúbulos segmentadas para estudar movimentos das microesferas revestidas com proteínas dependentes de microtúbulos, fornecendo insights sobre a capacidade de diferentes proteínas do motor e não motores a par de microtúbulos despolimerização ao movimento de carga processiva.

Introduction

Os microtúbulos são estruturas altamente conservadas do citoesqueleto, que são importantes para a arquitectura celular, motilidade celular, divisão celular e o transporte intracelular ^1. Estes polímeros dinâmicas montar a partir de tubulina na presença de GTP, e que exibir espontaneamente entre crescimento e encurtamento ^2. Os microtúbulos são muito finas (apenas 25 nm de diâmetro), portanto, técnicas ópticas especiais para melhorar o contraste deve ser usada para observar microtúbulos com um microscópio de luz. Trabalhos anteriores com esses polímeros examinado seu comportamento dinâmico usando contraste de interferência diferencial (DIC) ^3. Este e outros estudos in vitro mostraram que em condições experimentais típicas, os microtúbulos sofrer catástrofe e mude para a despolimerização apenas raramente, uma vez a cada 5-15 min (esta freqüência é de 7-15 mM concentração tubulina solúvel examinado em 28-32 ° C ) ^4. Diferentes técnicas têm sido, assim, propôs a induçãoe despolimerização de microtúbulos de maneira controlada. Microtúbulos encurtamento pode ser desencadeada por lavagem para retirar tubulina solúvel ^5,6, cortando microtúbulos com um feixe de laser ^7, ou usando microtúbulos segmentados ^8, tal como descrito aqui. Trabalhos anteriores utilizando microtúbulos segmentados, bem como polímeros estocasticamente de comutação, tem encontrado que as pequenas cargas intracelulares, tais como os cromossomas, vesículas, e pérolas revestidas com proteína, pode mover-se nas extremidades dos microtúbulos encurtamento ^9-13. Este fenômeno é pensado para ter uma implicação direta para movimentos cromossômicas em células mitóticas, e os mecanismos subjacentes estão atualmente sob investigação ativa ^14-16.

Recentemente, técnicas fluorescentes à base, incluindo o total de fluorescência reflexão interna (TIRF) microscopia, foram utilizados para estudar a motilidade com microtúbulos dinâmica termina ^17-24. A vantagem desta abordagem é que ela permite o exame de interacçãos entre os microtúbulos e proteínas de ligação de microtúbulos em tempo real, utilizando as proteínas marcadas com fluoróforos diferentes. Vários complexos de proteínas foram encontradas para mover processively com alongamento e / ou encurtar extremidades dos microtúbulos. Elas incluem as proteínas associadas a microtúbulos Dam1 ^10,12,18, Ska1 ^19, e XMAP215 ^20, bem como motores de cinesina Kif18A ^21,22, MCAK ²³ e CENP-E ^24. Estas proteínas apresentam processive ponta-tracking, que é fundamentalmente diferente daquele das proteínas de rastreamento de ponta clássicos como EB1 ^25. Embora as moléculas EB1 e os parceiros associados parecem permanecer estavelmente associada com microtúbulos dinâmica termina, as moléculas individuais permanecem ligados à extremidade do microtúbulo para apenas ~ 0,8 seg, rapidamente trocar com a piscina solúvel ^26. Em contraste, processive ponta dos trackers, como Dam1, viajar com microtúbulos termina para muitos microns, e sua associação com dicas de microtúbulos pode durar mquaisquer segundos. A ponta do tempo de associação, bem como a taxa resultante de acompanhamento, depende fortemente o número de moléculas que formam o complexo de localização da ponta ^27. Maiores conjuntos de proteínas são geralmente muito melhores ponta-trackers. Por exemplo, esses conjuntos complexos como os isolados de levedura cinetócoros pode permanecer acoplada a microtúbulos termina por ²⁸ horas. Algumas proteínas de ligação de microtúbulos, por exemplo, complexo de proteínas kinetochore Ndc80, foram encontrados para ser incapaz de acompanhar com microtúbulos termina no mesmo nível molécula, ainda Ndc80 é muito eficiente em acoplar o movimento de cargas talão ^19,29-31. Assim, para compreender o mecanismo de ponta de rastreamento por diferentes complexos de proteínas, bem como os seus papéis biológicos, é importante examinar ponta-rastreamento como uma função do número de moléculas do complexo de rastreamento de ponta, bem como para determinar a capacidade destes complexos para expor motilidade colectivo sobre a superfície de carga do grânulo.

<p class="jove_content"> Abaixo fornecemos protocolos detalhados para preparar e conduzir experimentos com microtúbulos segmentados (Figura 1A). Em primeiro lugar, as lâminas de vidro disponíveis no mercado são modificados para fixar tubos de polietileno curto (Protocolo 1). A câmara de fluxo de microscopia reutilizável é, então, montado a partir de tal slide eo limpa-plasma e lamela silanizada (protocolo 2) ^32-34 química ou. O volume da câmara resultante é apenas de 20-25 ul (ou tão pequenos quanto 15 ul, ver Nota 3 de protocolo 1), incluindo o volume do tubo de entrada. Câmaras de fluxo comercialmente disponíveis também podem ser utilizados, mas o seu volume é geralmente maior, o que leva ao desperdício desnecessário de proteínas. Se uma câmara maior é empregue, o volume de todas as soluções nos protocolos abaixo deve ser dimensionado proporcionalmente. Sementes de microtúbulos são então preparados, por exemplo, utilizando-se lentamente hidrolisável GTP analógico, GMPCPP (guanosina-5'-[(α, β)-methyleno] trifosfato) (protocolo 3, ver também Hyman <in> et al. ^35). As sementes são imobilizadas sobre uma lamela de limpeza e a superfície é bloqueada posteriormente para impedir a absorção não específica de outras proteínas de ³² (protocolo de 4 descreve sementes imobilização utilizando digoxigenina). Os microtúbulos segmentado pode, então, ser preparado utilizando o Protocolo 5. A principal razão para esta abordagem é que os polímeros de microtúbulos dinâmicos, que formam na presença de GTP, podem ser estabilizadas pela adição temporariamente as curtas "tampões" de segmentos de tubulina estáveis, que contêm GMPCPP. Estas cápsulas contêm também tubulina Rodamina marcado, de modo que pode ser removido simplesmente através da iluminação do campo de visão com um laser de 530-550 nm, ou uma lâmpada de arco de mercúrio (Protocolo 6) ^36. A intensidade de fluorescência do sinal de ponta-de controlo pode então ser utilizada para estimar o número de moléculas que se deslocam com as extremidades desmontagem de microtúbulos, tendo em conta a irregularidade da iluminação de campo do microscópio (Protocolo 7). Uma abordagem semelhante pode ser usadapara estudar as interacções entre os microtúbulos Despolimerização e pérolas revestidas com proteína, preparado como descrito em ²⁷ (Protocolo 8). Algumas proteínas irão ligar-se facilmente às paredes dos microtúbulos segmentadas, mas pinças a laser também pode ser utilizado para segurar o cordão perto da parede de microtúbulos, promovendo assim a sua ligação.

Protocol

Equipamentos necessários: As experiências descritas abaixo exigem um microscópio de luz equipado para DIC e imagens de fluorescência (Tabela 1). Campo brilhante iluminação LED pode ser utilizado para melhorar significativamente a detecção dos microtúbulos sementes ligado à lamela 37, que são difíceis de observar com uma lâmpada de halogéneo regular. Para controlar o fluxo de líquido em câmaras de microscopia, as soluções devem ser trocados com uma bomba peri…

Representative Results

Rastreamento com despolimerizando microtúbulos Protein termina. Yeast kinetochore componente Dam1 é de longe o melhor ponta-tracker do microtúbulos despolimerizando termina 14. O complexo de 10-subunidade marcada com GFP podem ser facilmente expressas e purificadas a partir de células bacterianas 18,38, portanto, recomendado usá-lo como um controlo positivo para o ensaio de localização da ponta. Uma proteína fluorescente que controla o fim da despolimerização de microtúb…

Discussion

Muitos ensaios única molécula hoje em dia usam rotineiramente lamelas especialmente tratadas para reduzir drasticamente a aderência proteína inespecífica. O procedimento que descrevemos aqui é uma modificação do protocolo original desenvolvido no laboratório de Howard ^32, e nós achamos que silanizar as lamelas vale bem a pena o esforço, mesmo com ensaios de contas baseadas em DIC, que não utilizam a fluorescência. Câmaras montadas com tais lamelas mostram superfícies muito mais limpas, e os res…

Materials

			Table 1: Microscopy and other equipment.
Microscope	Zeiss Nikon	Axio Imager 2 Eclipse Ti	other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used
Objective	Zeiss Nikon	420490-9900-000 CFI Apo 100x Oil 1.49	100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objective heater	Bioptechs	150803, 150819-19
Fluorescent filter cube	Chroma	49004 or 49008 41017 or 49020	optimized for Rhodamine fluorescence  optimized for GFP fluorescence
Acquisition software	freeware MicroManager Molecular Devices	not applicable MetaMorph 7.5	http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ other software can be used to acquire images and for a particle tracking
EMCCD camera	Andor	iXon3, DU-897E-cs0-#BV	Highly sensitive EMCCD camera
Trapping laser	IPG Photonics	YLR-10-1064-LP	1064 nm laser, 10 W
Fluorescence excitation lasers	Coherent, Inc. Coherent, Inc.	Sapphire 488 LP Sapphire 552 LP	excitation of green fluorophores excitation of red fluorophores
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001
Commercial flow chambers	Warner Instruments	RC-20 or RC-30
Perfusion pump	Cole Palmer Harvard Apparatus	Masterflex 77120-52 Pico Plus	Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.

			Table 2: Microscopy chamber preparation.
Modified microscope slides for reusable chambers	Precision Glassblowing of Colorado	Custom order www.precisionglassblowing.com	Sonic slots in slides using schematics in Figure 1
Polyethylene tubing	Intramedic	427410	I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container
Polyethylene tubing	Intramedic	427400	I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber
Regular microscope slides	VWR	48312-003	Other similar slides can be used
Coverslips	VWR	48393-150, 48366-067	Other similar coverslips can be used
Silicon sealant	World Precision Instruments	KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE
Epoxy glue	Loctite	83082
Cyanoacrylate adhesive	Scotch 3M	AD114	Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers

			Table 3: Coverslips cleaning and coating.
Molecular Sieves, Grade 564	Macron	4490-04
Coverglass Staining Jar	Ted Pella, Inc.	21036
Coverslip Ceramic Holder	Thomas Scientific	8542e40
PlusOne Repel Silane	GE Healthcare Biosciences	17-1332-01
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Anti-digoxigenin AB	Roche applied science	11093274910

			Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.
Tubulin	purified from cow brains Cytoskeleton, Inc	T238P	For purification protocols see 49–51 Unlabeled porcine tubulin
Labeled tubulin	Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen	TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenin)	Rhodamine-labeled porcine tubulin Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.
GMPCPP	Jena Biosciences	NU-405	Aliquot and store at -70 °C
VALAP	vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass		see ref. 9