Liquide céphalo-rachidien profilage de microARN Utilisation quantitative PCR en temps réel

Summary

Nous décrivons un protocole de PCR en temps réel pour le profil de microARN dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). A l'exception des protocoles d'extraction d'ARN, la procédure peut être étendue à l'ARN extrait à partir d'autres fluides corporels, des cellules en culture, ou des échantillons de tissus.

Abstract

Les microARN (miARN) constituent une couche puissante de la régulation des gènes en guidant RISC à cibler des sites situés sur des ARNm et, par conséquent, en modulant leur répression de la traduction. Changements dans l'expression des miARN ont été révélés être impliqués dans le développement de toutes les grandes maladies complexes. En outre, des études récentes ont montré que les miARN peuvent être sécrétées dans l'environnement extracellulaire et dans la circulation sanguine et d'autres fluides corporels où ils peuvent circuler avec une grande stabilité. La fonction de ces miARN circulation reste largement insaisissable, mais des approches à haut débit systématiques, telles que miRNA tableaux de profilage, ont conduit à l'identification de signatures miRNA dans plusieurs conditions pathologiques, y compris les maladies neurodégénératives et plusieurs types de cancers. Dans ce cadre, l'identification de miARN profil d'expression dans le liquide céphalo-rachidien, comme indiqué dans notre étude récente, rend miARN candidats intéressants pour l'analyse de marqueurs biologiques.

_content "> Il existe plusieurs outils disponibles pour le profilage de microARN, comme les puces, quantitative PCR en temps réel (qPCR), et le séquençage profond. Ici, nous décrivons une méthode sensible au profil microARN dans liquide céphalo-rachidien par PCR quantitative en temps réel. Nous utilisé les panneaux droits Exiqon microARN prêts à l'emploi PCR I et II V2.R, qui permet la détection de 742 microARN humains uniques. Nous avons effectué les tableaux en triple courses et nous avons traité et analysé les données en utilisant le logiciel GenEx Professional 5.

En utilisant ce protocole, nous avons profilé succès microARN dans divers types de lignées cellulaires et des cellules primaires, CSF, le plasma et les tissus inclus en paraffine fixés au formol.

Introduction

Les microARN appartiennent à la famille de la petite (21-23 nt de long) non codantes des ARN qui régulent l'expression des gènes post-transcriptionnel. microARN peuvent être sécrétées dans l'espace extracellulaire où ils semblent être relativement stables. Alors que la détermination des changements dans l'expression des miARN peut être une étape importante vers l'identification de biomarqueurs, effectuer profils miRNA et la manipulation d'une grande quantité de données peut être intimidant.

Ici, nous décrivons un protocole pour déterminer les changements dans l'expression des miARN dans le liquide céphalo-rachidien (applicable à d'autres fluides corporels) par un temps réel sensible PCR. Nous décrivons également l'utilisation de logiciels d'analyse de données, y compris l'analyse statistique et la représentation graphique des résultats. Toute la procédure est relativement simple et facile et, en fonction du nombre d'échantillons à profilés et le nombre de machines de PCR en temps réel disponibles, également relativement rapides. La partie expérimentale nécessite précision dans la manipulationARN et pipetage dans des plaques à 384 puits, tandis que la section d'analyse de données à l'aide GenEx nécessite quelques connaissances de base en informatique et en statistiques.

Protocol

Le protocole suivant décrit la procédure standard pour isoler l'ARN du CSF et profil microARN en utilisant des plaques de PCR prêts. Notez que l'extraction en phase organique est facultatif, et en ce qu'un ARN de support est ajouté à l'échantillon pendant l'extraction assurant la récupération maximale de l'ARN. Par conséquent, il n'est pas nécessaire de quantifier l'ARN. Dans l'ensemble, une moyenne de 6-8 plaques peut être exécuté en un jour …

Representative Results

Les résultats de cette étude ont été publiés 1. Figure 1 montre les résultats de l'analyse des micro-ARN de référence de candidats en utilisant l'application geNorm. En conséquence, deux microARN, miR-622 et miR-1266, ont été identifiés comme gènes de référence et ont été utilisés pour normaliser les valeurs de miARN. Pour l'étude du LCR, nous avions trois groupes d'échantillons: le VIH (n = 10), HIVE (n = 4), …

Discussion

Les microARN sont de petits ARN non codantes qui régulent l'expression des gènes par l'inhibition de la traduction et / ou de promotion de la dégradation de l'ARNm ^2. En raison de leur grande stabilité dans des conditions exemptes de cellules, les microARN ont été détectés dans de nombreux fluides corporels. En outre, le profil d'expression de microARN distinct a été corrélée avec le stade et / ou de la progression dans une variété de cancers chez l'homme ^9.3.

…

Materials

Table III. List of equipment

Equipment	Company	Catalog Number
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler® 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler® 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173

Table IV. List of reagents

Reagents	Company	Catalog Number
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2Betamercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap®	Ambion	AM9780