ECM Protein Nanofiberler ve Nanoyapılar İşlenmiş Kullanılarak Yüzey başlatılan Meclisi
Summary
Tek veya birden fazla hücre dışı matris proteinleri nanolifler ve karmaşık oluşturulan nano elde etmek için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, doku mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamalarında çeşitli kullanım için ayarlanabilir kompozisyon ve mimarisi ile serbest duran protein bazlı malzemeleri oluşturmak için protein-yüzey etkileşimlerini kullanır.
Abstract
Dokularda hücre dışı matris (ECM) sentezlenir ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş elyaf çapı, kompozisyon ve organizasyonu ile 3D Fibrillar'ı, protein bir şebekenin oluşturulması için hücreler tarafından monte edilir. Yapısal destek sağlamaya ek olarak, ECM'nin fiziksel ve kimyasal özellikleri, yapışma, farklılaşma ve apoptoz dahil olmak üzere çok sayıda hücresel süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. In vivo, ECM proteinleri içindeki şifreli kendini düzeneği (fibrillogenesis) siteleri maruz bırakılması ile monte edilir . Bu işlem, farklı proteinler için değişir, ancak fibronektin (FN) fibrillogenesis iyi karakterize edilmiş ve hücre-aracılı ECM montajı için bir model sistem olarak hizmet vermektedir. Spesifik hücreler, çözünmeyen lifler halinde montaj için bağlanma siteleri açılmak ve ortaya çıkarmak için FN dimerler ve aktomizin oluşturulan kasılma kuvvetleri bağlamak için, hücre zarı üzerinde integrin reseptörleri kullanın. Bu reseptör-aracılı süreç doku SCA için hücresel gelen ECM montajı ve organize hücreleri sağlarles. Burada, biz ECM proteinleri açılmak ve çözünmez liflerin içine monte protein-yüzey etkileşimleri kullanılarak hücre-aracılı matris düzeneğini özetlediği bir yöntem olarak adlandırılan yüzey başlatılan aksamını (SIA), sunuyoruz. İlk olarak, ECM proteinleri kısmen (katlanmış) denatüre ve şifreli bağlayıcı etki ortaya hidrofobik bir polidimetilsiloksan (PDMS) bir yüzey üzerine adsorbe edilir. Katlanmamış proteinler, termal olarak duyarlı poli (N-izopropil) (PIPAAm) yüzey üzerine microcontact baskı yoluyla iyi tanımlanmış mikro ve nanopatterns aktarılır. PIPAAm Termik tetiklenen çözünme nihai montaj ve iyi tanımlanmış geometriye sahip çözünmez ECM protein nanoliflerden ve nano salınmasına yol açar. Karmaşık mimarileri microcontact baskı için kullanılan PDMS pulları mühendislik tanımlı desenleri ile mümkündür. FN ek olarak, SIA işlem laminin, fibrinojen ile birlikte kullanılabilir ve kollajen I ve IV, çok bileşenli ECM nanostruc oluşturmak tiptures. Bu nedenle, in vivo olarak SIA ECM'nin yapısı ve bileşimi özetlemek amacıyla protein bileşimi, lif geometrisi ve iskele yapı üzerinde kesin kontrol ile ECM protein esaslı malzemelerin mühendislik için kullanılabilir.
Introduction
Dokularda hücre dışı matris (ECM) yapışma, çoğalma, farklılaşma ve apoptoz 1-3 de dahil olmak üzere birden fazla hücre süreçlerinin fiziksel ve kimyasal düzenlenmesinde rol oynayan çok işlevli proteinler oluşmaktadır. ECM, sentezlenen monte ve hücreler tarafından düzenlenen ve kurucu protein fibrillerinin doku tipine ve gelişim evresine göre değişkenlik eşsiz kompozisyonlar, lif boyutu, geometri ve birbirine mimarileri var olduğu. Son çalışma ECM bileşimi ve yapısı açısından ECM recapitulating doku mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamaları için biomimetic malzemelerin geliştirilmesini sağlayabilecek düşündüren, mühendislik dokular 4 oluşturacak hücreleri rehberlik öğretici ipuçları sağlayabilir göstermiştir.
Üretim yöntemleri bir dizi dokuda ECM yönlerini taklit edebilen polimerik yapı iskelesi mühendislik için geliştirilmiştir. Örneğin, elektro ve faz separtirme hem aşağı mikrometre onlarca nanometre 5-7 onlarca arasında değişen çaplarda liflerin gözenekli matrisler oluşturmak için yeteneğini göstermişlerdir. Her iki teknik de nanoliflerden çok gözenekli matrisler, skafoldun 8 içine, hücre yapışmasını ve infiltrasyon destekleyebilir göstermiştir. Ancak, bu yaklaşım oluşturulabilir olası fiber geometrileri, yönelimleri ve 3D mimarileri sınırlıdır. Faz ayrılması rasgele yönelimli liflerden ile yapı iskelesi oluşturur ise Elektrospinning tipik olarak rasgele bir şekilde yerleştirilen veya yüksek oranda hizalanmış ya da elyaf ile iskeleleri üretir. Malzemeler üzerinde sınırlamalar araştırmacılar, tipik haliyle, örneğin poli ardından hücre yapışmasını geliştirmek için ECM proteinleri ile kaplanır (ε-kaprolakton) 8 ve poli (laktik-ko-glikolik asit) 9, olduğu gibi, sentetik polimerler kullanarak, vardır. Doğal biyopolimerler de, kolajen tip I 10, jelatin 11, fibrinojen 12 de dahil olmak üzere, kullanılırçitosan 13 ve 14 ipek, fakat yerli dokusunda bulunan proteinlerin sadece küçük bir alt kümesini temsil etmektedir. En dokular mevcut yöntemlerle nanoliflerini imal etmek zor veya imkansız olan fibronektin (FN), laminin (LN), kollajen tip IV ve hyaluronik asit içeren ECM protein ve polisakaritlerin daha büyük bir ortam içerir.
Bu sorunu çözmek için, hücrelerin birleşmesi ve çevreleri ECM protein fıbriller düzenlemek, sentez yolu taklit bizim araştırma çabalarını odaklanmıştır. Belirli fibrillogenesis süreci farklı ECM proteinleri için değişmekle birlikte, tipik olarak, ECM protein molekülünde yapısal bir değişiklik şifreli montajı çok siteleri ortaya bir enzimatik ya da reseptör aracılı etkileşim tarafından tetiklenir. Burada daha iyi fibrillogenesis süreci anlamak için bir model sistem olarak FN kullanın. Kısaca, FN homodimerleri 10 tip II olarak RGD amino asit dizisi vasıtasıyla hücre yüzeyi üzerindeki integrin alıcıları için bağlananBen birim tekrarlayın. Bir kez bağlı, integrinler aktomizin daralması yoluyla ayrı hareket ve şifreli öz-montaj siteleri maruz FN dimerlerini açılmak. Bu FN-FN bağlanma sitelerinin maruz doğru hücre yüzeyi 15 çözünmeyen bir fibril halinde birleştirmek için FN dimerler sağlar. Hücresiz sistemlerde çalışma şifreli FN-FN bağlanma yerleri, bir hava-sıvı-katı ara 17-19 at denatüranlar 16 ya da yüzey gerilimini kullanan açılımı ile ortaya edilebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu teknikler ile oluşturulan FN lifler belli bir lif boyutunda ve geometrileri ile sınırlıdır ve tipik olarak bir yüzey bağlanmıştır.
Burada serbest çözünmez nanoliflerini, nanofabrics (2D yaprak) ve (Şekil 1 tek veya çoklu ECM proteinlerinin oluşan diğer nanoyapıları oluşturmak için protein-yüzey etkileşimleri kullanarak bu kısıtlamaların üstesinden bir yaklaşım olarak adlandırılan yüzey başlatılan aksamını (SIA) 20 tarif .) Bu process, ECM proteinleri çözelti içinde, kompakt, küresel yapıdan adsorbe edildi ve kısmen bir model, hidrofobik polidimetilsiloksan (PDMS) üzerine damgası (katlanmamış) denatüre edilmiştir. ECM sonra proteinler 22 baskı microcontact ile termal duyarlı poli (N-izopropil) (PIPAAm) yüzey üzerine bu durumda transfer edilir. 40 ° C, su ile hidratlanmış zaman PIPAAm sağlam kalır, ancak 32 ° C'ye kadar soğutuldu zaman hidrofilik hale düşük bir kritik çözelti sıcaklığı (LCST) içinden geçer, su ile şişen ve çözünen, kapalı monte ECM oluşturulan nano serbest yüzey. SIA yöntemi nanometre ölçekli hassasiyetle boyutları üzerinde kontrol sağlar. Bu kompozisyon, lif geometrisi ve mimari gibi başlıca parametreleri kontrol olarak, bu in vivo bulunan ECM'nin birçok özellikleri özetlemek için ve doku mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamalarında gelişmiş yapı iskelesi geliştirmek mümkündür.
Protocol
Representative Results
Discussion
SIA yöntem Burada taklit hücre-aracılı matriks aksamını sunulmaktadır ve ayarlanabilir boyut, organizasyon ve kompozisyon ile ECM protein nanoliflerden ve nano mühendislik sağlar. Hücre tarafından üretilen ECM özdeş olmasa da, SIA, mekanik gerilme sırasında açılımı 21 / geri katlama geçmesi ve hücreler 20 bağlanabilir, nano ölçekli protein fibrillerinin 20 oluşmaktadır ECM oluşturur. Bu, in vivo bulunan ECM birçok özellikleri özetlemek ECM protein …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mali destek NIH Müdürü Yeni Yenilikçi Ödülü (1DP2HL117750) den Dowd-ICES Bursu QJ ve AWF için, Rejeneratif Tıp T32 Eğitim Programı (2T32EB003392) olarak NIH Biyomekanik gelen JMS sağlanmıştır.
Materials
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
Riferimenti
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. . Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. l. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Teo, W. E., Ramakrishna, S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 17, (2006).
- Reneker, D. H., Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).
- Ma, P. X., Zhang, R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).
- Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. . Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).
- Huang, Z. -. M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer. 45, 5361-5368 (2004).
- Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. . Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Jin, H. -. J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).
- Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).
- Mosher, D. F., Johnson, R. B. In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers. Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).
- Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro. Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).
- Klotzsch, E., et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).
- Feinberg, A. W., Parker, K. K. Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics. Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).
- Deravi, L. F., et al. Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles. Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J Vis Exp. , 1065 (2008).
- Vogel, V. Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
