Stretching cellules Micropatterned sur une membrane PDMS
Summary
Ce manuscrit présente une technique d'appliquer ou libérer des forces sur les cellules ou les tissus adhérents utilisant étirement unidirectionnel.
Abstract
Les forces mécaniques qui s'exercent sur les cellules et / ou tissus jouent un rôle important dans de nombreux processus. Nous avons mis au point un dispositif pour étirer les cellules étalées sur un polydiméthylsiloxane (PDMS) membrane, compatible avec l'imagerie. Cette technique est reproductible et versatile. La membrane PDMS peut être microélectrodes pour confiner des cellules ou des tissus à une géométrie spécifique. La première étape consiste à imprimer micropatterns sur la membrane PDMS avec une technique de rayonnement UV lointain. La membrane PDMS est ensuite montée sur un châssis mécanique. Une chambre est tenue au-dessus de la membrane avec de la graisse biocompatible pour permettre glisse pendant l'étirement. Les cellules sont ensemencées et autorisés à se répandre pendant plusieurs heures sur les micropatterns. L'échantillon peut être étirée et non étirée à plusieurs reprises à l'aide d'une vis micrométrique. Il faut moins d'une minute pour appliquer le tronçon à sa pleine mesure (environ 30%). La technique présentée ici ne comprend pas un dispositif motorisé, qui est nécessaire pour unpplying cycles répétés d'étirement rapidement et / ou traction contrôlée ordinateur, mais cela peut être mis en œuvre. Stretching de cellules ou de tissus peut être d'intérêt pour les questions liées aux forces de cellules, la réponse cellulaire au stress mécanique ou la morphogenèse des tissus. Cette présentation vidéo vous montrera comment éviter les problèmes typiques qui peuvent survenir lorsque vous faites ce type d'expérience apparemment simple.
Introduction
Les cellules composant un tissu chez les organismes supérieurs sont soumis à des tensions mécaniques et les forces d'étirage provenant soit du milieu extérieur ou à partir de cellules environnantes 1,2. Les cellules doivent s'adapter et à résister à ces forces afin de maintenir l'intégrité des tissus. Ces forces sont également importantes pour la morphogenèse des tissus au cours du développement de 3,4. L'application de forces mécaniques sur des cellules en culture est une façon d'imiter ce qui pourrait arriver dans un tissu, mais avec un contrôle quantitatif et indépendante de la forme des cellules et la déformation de la cellule 5,6. Pour cela, plusieurs techniques peuvent être utilisées. On peut appuyer sur les cellules (la cellule entière ou une partie de celui-ci), par exemple en utilisant l'AFM ou dérivés 7,8 ou étirer le substrat, les cellules sont de plus en plus sur.
La méthode décrite dans cet article montre comment étirer un substrat plan avec des cellules plaquées. Cette technique a d'abord été mis au point pour évaluer le rôle des forces exercées sur mles cellules de mammifères itotic 9. Les cellules mitotiques rester connecté au substrat par des fibres de rétraction et d'étirement de la membrane une force exercée sur ces fibres, ce qui a provoqué la rotation du fuseau mitotique. L'intérêt de combiner micropatterns adhésives et d'étirement est de parvenir à un contrôle indépendant des forces et de la forme des cellules individuelles. Il est par exemple possible d'étirer une cellule ovoïde dans une forme ronde parfaitement isotrope, tandis que l'allongement uniaxial est appliquée. Si les cellules ne sont pas tressé sur micropatterns, étirage uniaxial résultats de l'allongement cellulaire, avec la plupart des cellules ayant un axe longitudinal aligné avec l'axe d'étirage. Il est alors difficile de séparer l'effet de l'alignement de l'axe long et l'effet de l'étirage appliqué aux cellules.
L'appareil est conçu pour toute l'imagerie des cellules vivantes, y compris longtemps microscopie laps de fluorescent, et les médicaments peut être ajouté lors de l'expérience. La méthode profonde UV micromodelage 10qui a été décrit en détail dans Azioune et al. Patterning 11 sur PDMS a été décrit dans Azioune et al. étirage 12 La présente protocole est une version vidéo de Carpi et al. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que cette technique a été utilisée à de nombreuses reprises et est testé en profondeur, il ya plusieurs étapes critiques qui peuvent conduire à une expérience ratée.
A propos des PDMS:
Pour ce travail, GelPak, une feuille de PDMS mince disponible dans le commerce, a été utilisé. Sinon feuilles PDMS peuvent être lancés directement à partir de PDMS mélange. Nous vous recommandons d'utiliser GelPak parce qu'il est plus reproductible, et est…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été fondée par l'Institut Curie, Paris, France. La civière mécanique a été conçu par Damien Cuvelier (Institut Curie) et est fabriqué par GREM (mecanique-grem.com). La structuration de PDMS a été développé par Ammar Azioune (Université Bordeaux II).
Materials
| GelPak | GelPak | PF-60-X4 | Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself. |
| Silicon grease | GE Bayer Silicones | Baysilone-Paste | This one is biocompatible |
| Stretching device | GREM mécanique | Stretcher 2011 | |
| EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) | Sigma | 3450 | Stable 6 months at -20 °C |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt) | Sigma | 56485 | Protect from humidity |
| Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg) | SurfaceSolutions (Zurich) | ||
| Synthetic Quartz photomask | Toppan | Take standard binary photomask in Quartz | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 |
Riferimenti
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