تمتد خلايا Micropatterned على غشاء PDMS
Summary
يقدم هذا المخطوط تقنية لتطبيق أو إطلاق القوات على الخلايا أو الأنسجة الملتصقة باستخدام أحادي الاتجاه تمتد.
Abstract
القوى الميكانيكية المبذولة على الخلايا و / أو الأنسجة تلعب دورا رئيسيا في عمليات عديدة. قمنا بتطوير جهاز لتمتد الخلايا مطلي على PolyDiMethylSiloxane (PDMS) الغشاء، متوافقة مع التصوير. هذا الأسلوب هو استنساخه وتنوعا. يمكن micropatterned الغشاء PDMS من أجل حصر الخلايا أو الأنسجة لهندسة محددة. فإن الخطوة الأولى هي لطباعة micropatterns على الغشاء PDMS مع تقنية الأشعة فوق البنفسجية العميقة. الغشاء PDMS ثم يتم تركيبه على محفة الميكانيكية. A غرفة لا بد على رأس الغشاء مع الشحوم حيويا للسماح مزلق أثناء التمدد. هي المصنفة الخلايا ويسمح لنشر لعدة ساعات على micropatterns. يمكن أن تمتد العينة وغير المتمدد عدة مرات مع استخدام المسمار المصغر. يستغرق أقل من دقيقة لتطبيق تمتد إلى أقصى مداها (حوالي 30٪). لا تتضمن هذه التقنية المعروضة هنا جهاز بمحركات، وهو أمر ضروري لpplying دورات تمتد المتكررة بسرعة و / أو الكمبيوتر التي تسيطر عليها وتمتد، ولكن هذا يمكن تنفيذها. تمتد من الخلايا أو الأنسجة يمكن أن تكون ذات فائدة للأسئلة المتعلقة القوات الخلية، استجابة الخلية لإجهاد ميكانيكي أو التشكل الأنسجة. وهذا عرض فيديو تظهر كيفية تجنب المشاكل النموذجية التي قد تنشأ عند القيام هذا النوع من التجربة التي تبدو بسيطة.
Introduction
الخلايا تتكون الأنسجة في الكائنات العليا تخضع لتوترات الميكانيكية وقوات تمتد القادمة سواء من البيئة الخارجية أو من الخلايا المحيطة 1،2. الخلايا يجب أن تتكيف مع ومقاومة هذه القوى من أجل الحفاظ على سلامة الأنسجة. هذه القوات مهمة للأنسجة التشكل خلال 3،4 التنمية. تطبيق القوى الميكانيكية على الخلايا المستزرعة هو وسيلة لمحاكاة ما يمكن أن يحدث في الأنسجة، ولكن مع مراقبة كمية ومستقلة عن شكل الخلية وتشوه الخلايا 5،6. لهذا، يمكن استخدام عدة تقنيات. يمكن للمرء أن تضغط على الخلايا (خلية كاملة أو جزء منه)، على سبيل المثال باستخدام AFM أو مشتقات 7،8 أو تمتد الركيزة الخلايا تنمو على.
الطريقة الموضحة في هذه الورقة يوضح كيفية تمتد ركيزة الطائرة مطلي مع الخلايا. وقد تم تطوير هذه التقنية في الأصل لتقييم دور القوات التي تمارس على مخلايا الثدييات itotic 9. الخلايا الإنقسامية البقاء على اتصال من خلال الركيزة الألياف التراجع وتمتد الغشاء تمارس القوة على تلك الألياف، والتي أثارت بدورها دوران المغزل الإنقسامية. مصلحة الجمع بين micropatterns لاصقة وتمتد هو تحقيق مراقبة مستقلة من القوات وشكل الخلايا الفردية. فمن الممكن على سبيل المثال أن تمتد خلية بيضوي الشكل في شكل دائري تماما الخواص، في حين يتم تطبيق تمتد ذو محورين. إذا لم يتم platted الخلايا على micropatterns، ذو محورين تمتد النتائج في استطالة الخلية، مع معظم الخلايا وجود محور طويل تتماشى مع محور التمدد. ومن ثم من الصعب فصل أثر محاذاة المحور الطويل وتأثير امتداد تطبيقها على الخلايا.
الجهاز هو مناسبة لأي التصوير الخلية الحية، بما في ذلك وقت طويل مضي فلوري المجهر، والمخدرات يمكن أن تضاف أثناء التجربة. طريقة UVs وmicropatterning عميق 10وقد وصفت بالتفصيل في Azioune وآخرون وصفت 11 الزخرفة على PDMS في Azioune وآخرون 12 الحاضر تمتد البروتوكول هو نسخة من الفيديو كاربي وآخرون 13
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن هذه التقنية قد استخدمت عدة مرات ويتم اختبارها بدقة، وهناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن تؤدي إلى فشل التجربة.
حول PDMS:
لهذا العمل، GelPak، ورقة PDMS رقيقة متوفرة تجاريا، استخ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تأسست هذا العمل من قبل معهد كوري، باريس، فرنسا. تم تصميم نقالة الميكانيكية من قبل داميان كوفيلير (معهد كوري) ويتم تصنيعها من قبل GREM (MECANIQUE-grem.com). تم تطوير الزخرفة على PDMS بواسطة عمار Azioune (جامعة بوردو الثاني).
Materials
| GelPak | GelPak | PF-60-X4 | Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself. |
| Silicon grease | GE Bayer Silicones | Baysilone-Paste | This one is biocompatible |
| Stretching device | GREM mécanique | Stretcher 2011 | |
| EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) | Sigma | 3450 | Stable 6 months at -20 °C |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt) | Sigma | 56485 | Protect from humidity |
| Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg) | SurfaceSolutions (Zurich) | ||
| Synthetic Quartz photomask | Toppan | Take standard binary photomask in Quartz | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 |
Riferimenti
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Terenna, C. R., et al. Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast. Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).
- Guillot, C., Lecuit, T. Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis. Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).
- Mitrossilis, D., et al. Real-time single-cell response to stiffness. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).
- Fink, J., et al. External forces control mitotic spindle positioning. Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs. Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).
- Azioune, A., et al. Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates. Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).
- Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs. Protoc. Exch. , (2011).
- Sinha, B., et al. Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae. Cell. 144 (3), 402-413 (2011).
