Strækker micropatterned Celler på en PDMS Membrane
Summary
Dette håndskrift præsenterer en teknik til at anvende eller frigive kræfter på vedhængende celler eller væv ved hjælp ensrettet strækning.
Abstract
Mekaniske kræfter, der udøves på celler og / eller væv spiller en vigtig rolle i en lang række processer. Vi har udviklet et apparat til at strække celler udpladet på en polydimethylsiloxan (PDMS) membran, der er forenelig med billeddannelse. Denne teknik er reproducerbar og alsidig. PDMS membran kan micropatterned for at begrænse celler eller væv til en bestemt geometri. Det første skridt er at udskrive micropatterns på PDMS membran med en dyb UV teknik. PDMS membran derpå monteret på en mekanisk båre. Et kammer er bundet på toppen af membranen med biokompatible fedt for at tillade glidende under stræk. Cellerne podes og får lov til at sprede sig i flere timer på micropatterns. Prøven kan strækkes og ustrakte flere gange med brug af en mikrometrisk skrue. Det tager mindre end et minut til at anvende den strækning i sin fulde udstrækning (ca. 30%). Den teknik, der præsenteres her ikke omfatter en motordrevet enhed, som er nødvendig for enpplying gentagne stretch cykler hurtigere og / eller computerstyret strække, men dette kan gennemføres. Strækker af celler eller væv kan være af interesse for spørgsmål vedrørende celle styrker, celle respons på mekanisk stress eller vævsmorfogenese. Denne video præsentation vil vise, hvordan man kan undgå typiske problemer, der kan opstå, når du laver denne type tilsyneladende simpelt eksperiment.
Introduction
Cellerne komponere et væv i højere organismer er underlagt mekaniske spændinger og strækker kræfter kommer enten fra det eksterne miljø eller fra de omkringliggende celler 1,2. Cellerne skal tilpasse sig og modstå disse kræfter for at bevare væv integritet. Sådanne kræfter er også vigtigt for væv morfogenese under udvikling 3,4. Anvende mekaniske kræfter på dyrkede celler er en måde at efterligne, hvad der kan ske i et væv, men med en kvantitativ og uafhængig kontrol af cellens form og celle deformation 5,6. Til dette, kan adskillige teknikker anvendes. Man kan trykke på cellerne (hele cellen eller en del af det), for eksempel ved hjælp af AFM eller derivater 7,8 eller strække underlaget cellerne vokser på.
Det er beskrevet i dette papir metode viser, hvordan man strække en plan substrat belagt med celler. Denne teknik blev oprindeligt udviklet til at vurdere rollen af kræfter, der udøves på mitotic pattedyrceller 9. Mitotiske celler holde forbindelsen til underlaget gennem tilbagetrækningselementer fibre og strækker membranen udøves en kraft på de fibre, der til gengæld gav anledning rotation mitotiske spindel. Interessen for at kombinere klæbende micropatterns og stretching er at opnå en uafhængig kontrol af kræfter og form af de enkelte celler. Det er for eksempel muligt at strække ægformede celle, i en helt isotropisk rund form, mens uniaksial strækning anvendes. Hvis cellerne ikke er flettede på micropatterns énakset strækning resulterer i celleforlængelse med de fleste celler, der har en længdeakse på linie med stretch akse. Det er da vanskeligt at adskille virkningerne af den lange akse tilpasning og virkningen af strækningen påføres cellerne.
Enheden er velegnet til alle levende celler, herunder lang tid bortfalder fluorescerende mikroskopi, og stoffer kan tilføjes under eksperimentet. Den dybe UVs micropatterning metode 10blev beskrevet i detaljer i Azioune et al. 11. Patterning på PDMS blev beskrevet i Azioune et al. 12. Den nuværende strækker protokol er en video-version af Carpi et al. 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om denne teknik har været anvendt adskillige gange, og er grundigt testet, er der flere kritiske trin, der kan føre til en mislykket forsøg.
Om PDMS:
For dette arbejde, GelPak et kommercielt tilgængeligt tynd PDMS plade blev anvendt. Alternativt PDMS plader kan støbes direkte fra PDMS mix. Vi anbefaler at bruge GelPak fordi det er mere reproducerbar, og er mindre tilbøjelige til at bryde i forhold til specialfremstillede PDMS.
Om…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev grundlagt af Institut Curie, Paris, Frankrig. Den mekaniske båre er designet af Damien Cuvelier (Institut Curie) og er fremstillet af GREM (mecanique-grem.com). Mønstret på PDMS blev udviklet af Ammar Azioune (Bordeaux II-universitetet).
Materials
| GelPak | GelPak | PF-60-X4 | Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself. |
| Silicon grease | GE Bayer Silicones | Baysilone-Paste | This one is biocompatible |
| Stretching device | GREM mécanique | Stretcher 2011 | |
| EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) | Sigma | 3450 | Stable 6 months at -20 °C |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt) | Sigma | 56485 | Protect from humidity |
| Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg) | SurfaceSolutions (Zurich) | ||
| Synthetic Quartz photomask | Toppan | Take standard binary photomask in Quartz | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 |
Riferimenti
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Terenna, C. R., et al. Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast. Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).
- Guillot, C., Lecuit, T. Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis. Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).
- Mitrossilis, D., et al. Real-time single-cell response to stiffness. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).
- Fink, J., et al. External forces control mitotic spindle positioning. Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs. Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).
- Azioune, A., et al. Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates. Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).
- Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs. Protoc. Exch. , (2011).
- Sinha, B., et al. Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae. Cell. 144 (3), 402-413 (2011).
