फ्लोरोसेंटली लेबल वाले उपभेदों के कोकृषण द्वारा बैक्टीरियल सेल आबादी में इंट्रास्पेसेज प्रतियोगिता की निगरानी करना
Summary
बैक्टीरिया अपने जीवनकाल के दौरान या तो हानिकारक या फायदेमंद उत्परिवर्तन जमा कर सकते हैं। कोशिकाओं की आबादी में उन व्यक्तियों की आबादी जो लाभकारी उत्परिवर्तन जमा करते हैं, तेजी से अपने साथियों को मात खा सकते हैं। यहां हम फ्लोरोसेंटली लेबल वाले व्यक्तियों का उपयोग करके समय के साथ बैक्टीरियल सेल आबादी में इंट्राप्रजातियों की प्रतिस्पर्धा की कल्पना करने के लिए एक सरल प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
बैक्टीरिया जैसे कई सूक्ष्मजीव बहुत तेजी से पैदा होते हैं और आबादी उच्च कोशिका घनत्व तक पहुंच सकती है। जनसंख्या में कोशिकाओं के छोटे अंशों में हमेशा जमा उत्परिवर्तन होते हैं जो या तो हानिकारक होते हैं या कोशिका के लिए फायदेमंद होते हैं। यदि उत्परिवर्तन का फिटनेस प्रभाव एक मजबूत चयनात्मक विकास लाभ के साथ उपआबादी प्रदान करता है, तो इस उपजनसंख्या के व्यक्ति तेजी से प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं और यहां तक कि अपने तत्काल साथियों को पूरी तरह से खत्म कर सकते हैं। इस प्रकार, छोटे आनुवंशिक परिवर्तन और कोशिकाओं के चयन संचालित संचय है कि लाभकारी उत्परिवर्तन हासिल कर लिया है एक सेल आबादी के जीनोटाइप का एक पूरा बदलाव करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यहां हम ग्राम-सकारात्मक मॉडल जीवाणु जीवाणु उपतिलिसके व्यक्तियों को फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए फ्लोरोसेंटली लेबल के अनुकूल द्वारा समय के साथ बैक्टीरियल सेल आबादी में क्रमशः लाभकारी और हानिकारक उत्परिवर्तनों के तेजी से क्लोनल विस्तार और उन्मूलन की निगरानी करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। विधि एक जीवाणु कोशिका आबादी में व्यक्तियों के बीच इंट्राप्रजाति प्रतिस्पर्धा प्रदर्शित करने के लिए प्रदर्शन करना आसान और बहुत उदाहरण है।
Introduction
मृदा बैक्टीरिया आमतौर पर लचीले नियामक नेटवर्क और व्यापक चयापचय क्षमताओं से संपन्न होते हैं। दोनों विशेषताएं कोशिकाओं को पोषक तत्वों के लिए अपने साथियों और अन्य सूक्ष्मजीवों के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए अपने कैटाबोलिक और एनाबोलिक रास्तों को समायोजित करने में सक्षम करती हैं, जो किसी दिए गए पारिस्थितिक आला1में उपलब्ध हैं। हालांकि, अगर बैक्टीरिया अपने पर्यावरण के लिए अनुकूल करने में असमर्थ हैं अन्य तंत्र एक प्रजाति के अस्तित्व के लिए खाते में हो सकता है। दरअसल, के रूप में कई बैक्टीरिया तेजी से पैदा होता है और आबादी उच्च सेल घनत्व उपआबादी तक पहुंच सकते है अनायास लाभप्रद उत्परिवर्तन है कि एक चयनात्मक विकास लाभ के साथ कोशिकाओं को प्रदान करते है और इसलिए उनकी फिटनेस में वृद्धि जमा हो सकता है । इसके अलावा, उत्परिवर्तनीय हॉटस्पॉट और तनाव-प्रेरित अनुकूली म्यूटेनेसिस एक मैलाडैप्टेड जीवाणु2,3के विकास की सुविधा प्रदान कर सकता है। इस प्रकार, निरंतर चयन के तहत उत्परिवर्तन और विकास का संचय विशाल माइक्रोबियल विविधता के लिए मूल है, यहां तक कि एक ही जीनस4,5के भीतर भी। प्रकृति के रूप में, चयन के तहत निरंतर खेती के कारण प्रयोगशाला में जीवाणु जीनोम को आकार देना भी होता है। इसका उदाहरण ग्राम-सकारात्मक जीवाणु बी उपटिलि के पालतू जानवरों द्वारा किया जाता है, जिसका उपयोग दुनिया भर में बुनियादी अनुसंधान और उद्योग में किया जाता है। 1940 के दशक में बी सबटिलिस डीएनए हानिकारक एक्स-रे के साथ इलाज किया गया था और एक विशिष्ट विकास की स्थिति6के तहत खेती के बाद । कई विकास विशेषताओं के नुकसान के लिए उनके पालतू खाते के दौरान बैक्टीरिया में जमा हुए उत्परिवर्तन, यानी बी सबटिलिस प्रयोगशाला तनाव 168 ने जटिल उपनिवेशों को7,8बनाने की क्षमता खो दी।
आजकल, सबसे अच्छा अध्ययन मॉडल बैक्टीरिया Escherichia कोलाई और बी उपटिलिके लिए, शक्तिशाली उपकरणों की एक किस्म आनुवंशिक रूप से अपने जीनोम में हेरफेर करने के लिए विशिष्ट वैज्ञानिक सवालों को संबोधित करने के लिए उपलब्ध है । कभी-कभी ब्याज के जीन की निष्क्रियता एक गंभीर विकास दोष का कारण बनती है, जो तब मानक विकास माध्यम9पर स्पष्ट रूप से दिखाई देती है। इसके विपरीत, उत्परिवर्तन जो कमजोर विकास दोष का कारण बनते हैं और इस प्रकार केवल थोड़ा तनाव की फिटनेस को प्रभावित करते हैं, अक्सर नजरअंदाज कर दिए जाते हैं। हालांकि, दोनों ही मामलों में कई पीढ़ियों के लिए उत्परिवर्ती उपभेदों के लंबे समय तक इनक्यूबेशन और पासिंग के परिणामस्वरूप आमतौर पर दमनक म्यूटेंट का संचय होता है जिसने माता-पिता के तनाव2,9के फेनोटाइप को बहाल कर दिया है। दमनक म्यूटेंट का लक्षण वर्णन और उत्परिवर्तनों की पहचान जिसने मूल उत्परिवर्ती तनाव के विकास दोष को बहाल किया है, एक बहुत ही उपयोगी दृष्टिकोण है जो महत्वपूर्ण और अक्सर उपन्यास सेलुलर प्रक्रियाओं को स्पष्ट करने की अनुमति देता है10,11।
हम बी सबटिलिस12में ग्लूटामेट होयोस्टेसिस के नियंत्रण में रुचि रखते हैं । ई कोलाईके समान, बी सबटिलिस ग्लूटामेट हो्योस्टेसिस(यानीग्लूटामेट रक्षित क्षरण2में ब्लॉक) के संवर्तन का जवाब देता है। सहज उत्परिवर्तन द्वारा प्राप्त किए गए इन दमनरोधी म्यूटेंट में जीनोमिक परिवर्तन ों को ग्लूटामेट होमोस्टेसिस9,13को तेजी से बहाल करने के लिए दिखाया गया था। इसलिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि जीवाणु के पालतू के दौरान एक विशिष्ट विकास स्थिति में बी उपटिलि का अनुकूलन एंजाइम संश्लेषण में और विकसित एंजाइमेटिक गतिविधियों में प्रतिबिंबित होता है, जो ग्लूटामेट मेटाबोलिज्म12में शामिल हैं। यह सुझाव दिया गया है कि पालतू बनाने की प्रक्रिया के दौरान विकास माध्यम में बहिर्जात ग्लूटामेट की कमी प्रयोगशाला तनाव 1682,14में गुप्त ग्लूटामेट डेहाइड्रोजनेज (जीडीएच) गुड्बसीआर जीन के उद्भव और निर्धारण के लिए प्रेरक शक्ति थी। इस परिकल्पना को हमारे इस अवलोकन द्वारा समर्थन दिया जाता है कि प्रयोगशाला तनाव में जीडीएच गतिविधि की कम मात्रा बैक्टीरिया को एक चयनात्मक विकास लाभ प्रदान करती है जब बहिर्जात ग्लूटामेट दुर्लभ होता है2. इसके अलावा, बी सबटिलिस स्ट्रेन की खेती, जीडीएच गुड्ब को संश्लेषित करते हुए, बहिर्जात ग्लूटामेट के अभाव में दमनक म्यूटेंट के संचय में परिणाम होता है जिसने गुड्ब जीन2को निष्क्रिय कर दिया है। जाहिर है, कैटाबोलिक रूप से सक्रिय GDH की उपस्थिति कोशिका के लिए हानिकारक है क्योंकि अंतर्जात रूप से निर्मित ग्लूटामेट जिसका उपयोग अन्यथा एनाबोलिज्म के लिए किया जा सकता है, अमोनियम और 2-ऑक्सोग्लूटारेट(चित्रा 1)के लिए अपमानित किया जाता है। इसके विपरीत, जब ग्लूटामेट माध्यम द्वारा प्रदान किया जाता है, तो उच्च स्तरीय GDH गतिविधि से लैस बी सबटिलिस तनाव में एक तनाव पर चयनात्मक विकास लाभ होता है जो केवल एक कार्यात्मक GDH को संश्लेषित करता है। यह मानना उचित है कि उच्च स्तरीय GDH गतिविधि बैक्टीरिया को मध्यम2 द्वारा प्रदान किए गए अन्य कार्बन स्रोतों के अलावा दूसरे कार्बन स्रोत के रूप में ग्लूटामेट का उपयोग करने की अनुमति देती है (चित्र 1 देखें)। इस प्रकार, जीडीएच गतिविधि एक्सोजेनस ग्लूटामेट की उपलब्धता के आधार पर बैक्टीरिया की फिटनेस को दृढ़ता से प्रभावित करती है।
यहां हम दो बी सबटिलिस उपभेदों के बीच इंट्राप्रजाति प्रतिस्पर्धा की निगरानी और कल्पना करने के लिए एक बहुत ही उदाहरण विधि प्रस्तुत करते हैं जो गुणसूत्र(चित्रा 2)पर एक ही लोकस में भिन्न होते हैं। दो उपभेदों को वाईएफपी और सीएफपी जीन के साथ फ्लोरोफोरस वाईएफपी और सीएफपी को एन्कोडिंग और विभिन्न पोषण स्थितियों के तहत cocultivated के साथ लेबल किया गया था । समय के साथ नमूना लेने और आगर प्लेटों पर उचित कमजोर पड़ने चढ़ाना द्वारा संस्कृतियों में से प्रत्येक में बचे आसानी से एक आम स्टीरियो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर निगरानी की जा सकती है । इस पेपर में वर्णित प्रक्रिया समय के साथ सेल आबादी में क्रमशः लाभकारी और हानिकारक उत्परिवर्तनों के तेजी से क्लोनल विस्तार और उन्मूलन की कल्पना करने के लिए प्रदर्शन करना आसान और उपयुक्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
बैक्टीरिया की प्रतिस्पर्धी फिटनेस का विश्लेषण करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं16. कई मामलों में बैक्टीरिया को विभिन्न एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट17के साथ लेबल किया गया था । हमारे दृष्टिको…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों की प्रयोगशाला में काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; सीओ 1139/1-1), प्रिय डेर चेमिसचेन इंडस्ट्रीज (http://www.vci.de/fonds), और गोटिंगेन सेंटर फॉर मॉलिक्यूलर बायोलॉजी (GZMB) । लेखक सहायक टिप्पणियों और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जोर्ग स्टलके को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| (NH4)2SO4 | Roth, Germany | 3746 | – |
| Agar | Difco, USA | 214010 | – |
| Ammonium ferric citrate (CAF) | Sigma-Aldrich, Germany | 9714 | – |
| CaCl2 | Roth, Germany | 5239 | – |
| Glucose | Applichem, Germany | A3617 | – |
| Glycerol | Roth, Germany | 4043 | – |
| K2HPO4 x 3 H2O | Roth, Germany | 6878 | – |
| KCl | Applichem, Germany | A3582 | – |
| KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | – |
| KOH | Roth, Germany | 6751 | – |
| MgSO4 x 7 H2O | Roth, Germany | P027 | – |
| MnCl2 | Roth, Germany | T881 | – |
| MnSO4 x 4 H2O | Merck Millipore, Germany | 102786 | – |
| NaCl | Roth, Germany | 9265 | – |
| Nutrient broth | Roth, Germany | X929 | – |
| Potassium glutamate | Applichem, Germany | A3712 | – |
| Tryptone | Roth, Germany | 8952 | – |
| Tryptophan | Applichem, Germany | A3445 | – |
| Yeast extract | Roth, Germany | 2363 | – |
| 1.5 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,690,001 | – |
| 2.0 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,691 | – |
| 15 ml Plastic tubes with screw cap | Sarstedt, Germany | 62,554,001 | – |
| Petri dishes | Sarstedt, Germany | 82.1473 | – |
| 1.5 ml Polystyrene cuvettes | Sarstedt, Germany | 67,742 | – |
| 15 ml Glass culture tubes | Brand, Germany | 7790 22 | – |
| with aluminium caps | |||
| 100 ml Shake flasks with aluminium caps | Brand, Germany | 928 24 | – |
| Sterile 10 ml glass pipettes | Brand, Germany | 278 23 | – |
| Incubator (28 and 37 °C) | New Brunswick | M1282-0012 | – |
| Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl) | Eppendorf, Germany | 4910 000.034, 4910 000.042, | – |
| 4910 000.042, | |||
| 4910 000.069 | |||
| Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany | 75002425 | – |
| Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes | Heraeus Biofuge Primo R, Germany | 75005440 | – |
| Standard spectrophotometer | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany | 80-2112-21 | – |
| Stereofluorescence microscope | Zeiss SteREO Lumar V12, Germany | 495008-0009-000 | – |
| Freezer (-20 and -80 °C) | – | – | – |
| Fridge (4 °C) | – | – | – |
| Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, Germany | – | – |
| pH meter | pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany | 766 | – |
| Vortex | Vortex 3, IKA, Germany | 3340000 | – |
| Balance | CP2202S, Sartorius, Germany | replaced by | – |
| CPA2202S | |||
| Black pen (permanent marker) | Staedler, Germany | 317-9 | – |
| Powerpoint program | Microsoft, USA | – | – |
| Office Excel program | Microsoft, USA | – | Program for data processing |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | replaced by CS6, download | Computer program for image processing |
| Computer | PC or Mac | – | – |
| ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope | Zeiss, Germany | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss |
| Specific solution recipes | |||
| SP medium | |||
| 8 g Nutrient broth | |||
| 0.25 mg MgSO4 x 7 H2O | |||
| 1 g KCl | |||
| if required, add 15 g agar for solid SP medium | |||
| ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| 1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration | |||
| 1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration | |||
| 2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| LB medium | |||
| 10 g Tryptone | |||
| 5 g Yeast extract | |||
| 10 g NaCl | |||
| if required, add 15 g agar for solid LB medium | |||
| ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| C-Glc minimal medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
| ad 1 l with sterile H2O | |||
| CE-Glc minimal medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 20 ml Glutamate (40%) | |||
| 25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
| ad 1 l with sterile H2O | |||
| 5 x C salts | |||
| 20 g KH2PO4 | |||
| 80 g K2HPO4 x 3 H2O | |||
| 16.5 g (NH4)2SO4 | |||
| ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| III’ salts | |||
| 0.232 g MnSO4 x 4 H2O | |||
| 12.3 g MgSO4 x 7 H2O | |||
| ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| 40% Glutamate solution | |||
| 200 g L-Glutamic acid | |||
| adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH | |||
| ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| 0.9% Saline (NaCl) solution | |||
| ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| 50% Glycerol solution | |||
| 295 ml Glycerol (87%) | |||
| ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168) | |||
| Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) | Laboratory strain collection | ||
| Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp) | |||
Riferimenti
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