Surveillance de la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes par cocultivation de souches marquées par fluorescence

Summary

Les bactéries peuvent accumuler des mutations néfastes ou bénéfiques au cours de leur vie. Dans une population de cellules, les individus qui ont accumulé des mutations bénéfiques peuvent rapidement surpasser leurs semblables. Ici, nous présentons une procédure simple pour visualiser la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes au fil du temps en utilisant des individus marqués par fluorescence.

Abstract

De nombreux micro-organismes tels que les bactéries prolifèrent extrêmement rapidement et les populations peuvent atteindre des densités cellulaires élevées. De petites fractions de cellules dans une population ont toujours accumulé des mutations qui sont préjudiciables ou bénéfiques pour la cellule. Si l’effet de valeur adaptative d’une mutation procure à la sous-population un fort avantage de croissance sélective, les individus de cette sous-population peuvent rapidement supprèter et même éliminer complètement leurs compagnons immédiats. Ainsi, de petits changements génétiques et l’accumulation pilotée par la sélection de cellules qui ont acquis des mutations bénéfiques peuvent conduire à un déplacement complet du génotype d’une population cellulaire. Nous présentons ici une procédure pour surveiller l’expansion clonale rapide et l’élimination des mutations bénéfiques et néfastes, respectivement, dans une population de cellules bactériennes au fil du temps par cocultivation d’individus marqués par fluorescence de la bactérie modèle Gram-positive Bacillus subtilis. La méthode est facile à réaliser et très illustrative pour montrer la compétition intraspéciféenne entre les individus dans une population cellulaire bactérienne.

Introduction

Les bactéries du sol sont généralement dotées de réseaux de régulation flexibles et de vastes capacités métaboliques. Les deux caractéristiques permettent aux cellules d’ajuster leurs voies cataboliques et anaboliques pour rivaliser avec leurs semblables et d’autres micro-organismes pour les nutriments, qui sont disponibles dans une niche écologique donnée¹. Cependant, si les bactéries sont incapables de s’adapter à leur environnement, d’autres mécanismes peuvent expliquer la survie d’une espèce. En effet, comme de nombreuses bactéries prolifèrent rapidement et que les populations peuvent atteindre des densités cellulaires élevées, les sous-populations peuvent avoir spontanément accumulé des mutations bénéfiques qui procurent aux cellules un avantage de croissance sélective et augmentent donc leur aptitude. De plus, les points chauds mutationnels et la mutagenèse adaptative induite par le stress peuvent faciliter l’évolution d’une bactérie mal adaptée^2,3. Ainsi, l’accumulation de mutations et la croissance sous sélection continue est à l’origine de l’énorme diversité microbienne, même au sein d’un même genre^4,5. Comme dans la nature, la mise en forme des génomes bactériens se produit également en laboratoire en raison de la culture continue sous sélection. Ceci est illustré par la domestication de la bactérie Gram-positive B. subtilis, qui est utilisée dans le monde entier dans la recherche fondamentale et dans l’industrie. Dans les années 1940, B. subtilis a été traité avec des rayons X dommageables pour l’ADN, suivi d’une culture dans une condition de croissance spécifique^6. Les mutations qui se sont accumulées dans les bactéries lors de leur domestication expliquent la perte de nombreuses caractéristiques de croissance, c’est-à-dire que la souche de laboratoire B. subtilis 168 a perdu la capacité de former des colonies complexes^7,8.

De nos jours, pour les bactéries modèles les mieux étudiées Escherichia coli et B. subtilis,une variété d’outils puissants est disponible pour manipuler génétiquement leurs génomes afin de répondre à des questions scientifiques spécifiques. Parfois, l’inactivation d’un gène d’intérêt provoque un grave défaut de croissance, qui est alors clairement visible sur le milieu de croissance standard⁹. En revanche, les mutations qui provoquent un défaut de croissance faible et n’affectent donc que légèrement la forme physique de la souche sont souvent ignorées. Cependant, dans les deux cas, l’incubation et le passaging prolongés des souches mutantes pendant plusieurs générations entraînent généralement l’accumulation de mutants suppresseurs qui ont restauré le phénotype de la souche parente^2,9. La caractérisation des mutants suppresseurs et l’identification des mutations qui ont restauré le défaut de croissance de la souche mutante mère est une approche très utile qui permet d’élucider des processus cellulaires importants et souvent nouveaux^10,11.

Nous nous intéressons au contrôle de l’homéostasie du glutamate chez B. subtilis¹². Semblable à E. coli, B. subtilis répond à la perturbation de l’homéostasie du glutamate(c’est-à-direle blocage dans la dégradation du glutamate²⁾par l’accumulation de mutants suppresseurs. Les changements genomic de ces mutants suppresseurs qui ont été acquis par mutation spontanée ont été montrés pour reconstituer rapidement l’homéostasie de glutamate^9,13. Par conséquent, il n’est pas surprenant que l’adaptation de B. subtilis à une condition de croissance spécifique lors de la domestication de la bactérie se reflète dans la synthèse enzymatique et dans les activités enzymatiques évoluées, qui sont impliquées dans le métabolisme du glutamate^12. Il a été suggéré que le manque de glutamate exogène dans le milieu de croissance pendant le processus de domestication ait été la force motrice de l’émergence et de la fixation du gène cryptique de la glutamate déshydrogénase (GDH) gudB^CR dans la souche de laboratoire 168^2,14. Cette hypothèse est soutenue par notre observation que la quantité réduite d’activité de GDH dans la souche de laboratoire fournit aux bactéries un avantage de croissance sélective quand le glutamate exogène est rare^2. De plus, la culture d’une souche de B. subtilis, synthétisant le GDH GudB, en l’absence de glutamate exogène entraîne l’accumulation de mutants suppresseurs qui ont inactivé le gène gudB ^2. De toute évidence, la présence d’un GDH cataboliquement actif est désavantageuse pour la cellule car le glutamate produit de manière endogène qui pourrait autrement être utilisé pour l’anabolisme est dégradé en ammonium et en 2-oxoglutarate (Figure 1). En revanche, lorsque le glutamate est fourni par le milieu, une souche de B. subtilis équipée d’une activité GDH de haut niveau a un avantage de croissance sélective par rapport à une souche qui ne synthétise qu’un seul GDH fonctionnel. Il est raisonnable de supposer que l’activité GDH de haut niveau permet aux bactéries d’utiliser le glutamate comme deuxième source de carbone en plus des autres sources de carbone fournies par le milieu² (voir figure 1). Ainsi, l’activité GDH affecte fortement la forme physique des bactéries, en fonction de la disponibilité du glutamate exogène.

Nous présentons ici une méthode très illustrative pour surveiller et visualiser la concurrence intraspécifiques entre deux souches de B. subtilis qui diffèrent par un seul locus sur le chromosome (Figure 2). Les deux souches ont été étiquetées avec les gènes yfp et cfp codant pour les fluorophores YFP et CFP, et cocultivées dans différentes conditions nutritionnelles. En prélevant des échantillons au fil du temps et en plaquant des dilutions appropriées sur des plaques de gélose, les survivants de chacune des cultures ont pu être facilement surveillés à l’aide d’un microscope à fluorescence stéréo commun. Le procédé décrit en ce document est facile à exécuter et approprié pour visualiser l’expansion et l’élimination clonales rapides des mutations salutaires et préjudiciables, respectivement, dans une population de cellules au fil du temps.

Protocol

1. Préparation des plaques de gélose, des milieux de culture, des cryostocks et des précultures Préparer les milieux de croissance et les réactifs requis (voir le tableau des matériaux et des réactifs). Stries les souches de B. subtilis ( par exemple. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) et BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) exprimant respectivement un et…

Representative Results

La méthode décrite ici a été appliquée avec succès pour visualiser la compétition intraspécifique dans une population cellulaire constituée de souches de B. subtilis qui ont été marqués avec les gènes cfp et yfp codant pour les fluorophores CFP et YFP, respectivement. Comme le montre la figure 3,la méthode peut être utilisée pour visualiser la concurrence intraspécifeur d’une manière très illustrative. En repérant les échantillons sur de petites zones, la…

Discussion

Plusieurs méthodes ont été développées pour analyser l’aptitude compétitive des bactéries¹⁶. Dans de nombreux cas, les bactéries ont été étiquetées avec différentes cassettes de résistance aux antibiotiques¹⁷. Semblable à notre approche, l’étiquetage des cellules avec des cassettes de résistance aux antibiotiques permet l’évaluation de l’aptitude compétitive des bactéries lors de la cocultivation dans des conditions de croissance définies. De plus, cette méthode peut ê…

Materials

(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746	–
Agar	Difco, USA	214010	–
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714	–
CaCl2	Roth, Germany	5239	–
Glucose	Applichem, Germany	A3617	–
Glycerol	Roth, Germany	4043	–
K2HPO4 x 3 H2O	Roth, Germany	6878	–
KCl	Applichem, Germany	A3582	–
KH2PO4	Roth, Germany	3904	–
KOH	Roth, Germany	6751	–
MgSO4 x 7 H2O	Roth, Germany	P027	–
MnCl2	Roth, Germany	T881	–
MnSO4 x 4 H2O	Merck Millipore, Germany	102786	–
NaCl	Roth, Germany	9265	–
Nutrient broth	Roth, Germany	X929	–
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712	–
Tryptone	Roth, Germany	8952	–
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445	–
Yeast extract	Roth, Germany	2363	–
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001	–
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691	–
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001	–
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473	–
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742	–
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22	–
with aluminium caps
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24	–
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23	–
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012	–
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,	–
		4910 000.042,
		4910 000.069
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425	–
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440	–
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21	–
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000	–
Freezer (-20 and -80 °C)	–	–	–
Fridge (4 °C)	–	–	–
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	–	–
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766	–
Vortex	Vortex  3, IKA, Germany	3340000	–
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by	–
		CPA2202S
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9	–
Powerpoint program	Microsoft, USA	–	–
Office Excel program	Microsoft, USA	–	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	–	–
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4 x 7 H2O
1 g KCl
if required, add 15 g agar for solid SP medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
if required, add 15 g agar for solid LB medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
CE-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4 x 3 H2O
16.5 g (NH4)2SO4
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4 x 4 H2O
12.3 g MgSO4 x 7 H2O
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) solution
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)			Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)