Overvågning intraspecies konkurrence i en bakteriel cellepopulation ved cocultivation af fluorescerende mærkede stammer

Summary

Bakterier kan ophobes enten skadelige eller gavnlige mutationer i løbet af deres levetid. I en population af celler personer, der har akkumuleret gavnlige mutationer kan hurtigt udkonkurrere deres medmennesker. Her præsenterer vi en simpel procedure for at visualisere intraspecies konkurrence i en bakteriel cellepopulation over tid ved hjælp af fluorescerende mærkede individer.

Abstract

Mange mikroorganismer såsom bakterier formere sig ekstremt hurtigt, og befolkningen kan nå høje celletætheder. Små fraktioner af celler i en population har altid akkumulerede mutationer, der enten er skadelige eller gavnlige for cellen. Hvis fitnesseffekten af en mutation giver delpopulationen en stærk selektiv vækstfordel, kan individerne af denne delpopulation hurtigt udkonkurrere og endda helt eliminere deres umiddelbare stipendiater. Små genetiske ændringer og udvælgelsesdrevet akkumulering af celler, der har erhvervet gavnlige mutationer, kan således føre til et fuldstændigt skift af genotypen for en cellepopulation. Her præsenterer vi en procedure for at overvåge den hurtige klonudvidelse og eliminering af henholdsvis gavnlige og skadelige mutationer i en bakteriecellepopulation over tid ved cocultivation af fluorescerende mærkede individer af grampositiv modelbakterien Bacillus subtilis. Metoden er let at udføre og meget illustrativ at vise intraspecies konkurrence blandt individerne i en bakteriel cellepopulation.

Introduction

Jordbakterier er normalt udstyret med fleksible reguleringsnetværk og bred metabolisk kapacitet. Begge funktioner gør det muligt for cellerne at justere deres katabolske og anabolske veje for at konkurrere med deres medmennesker og andre mikroorganismer for næringsstofferne, som er tilgængelige i en given økologisk niche¹. Men hvis bakterierne ikke er i stand til at tilpasse sig deres miljø andre mekanismer kan tegne sig for overlevelse af en art. Faktisk, som mange bakterier formere sig hurtigt og befolkningen kan nå høje celletætheder delpopulationer kan have spontant akkumuleret gavnlige mutationer, der giver cellerne med en selektiv vækst fordel og derfor øge deres egnethed. Desuden kan mutationelle hotspots og stress-induceret adaptiv mutagenese lette udviklingen af en maladapted bakterie^2,3. Således er akkumulering af mutationer og vækst under kontinuerlig udvælgelse oprindelsen til den enorme mikrobielle mangfoldighed, selv inden for samme slægt^4,5. Som i naturen forekommer formning af bakterielle genomer også i laboratoriet på grund af kontinuerlig dyrkning under udvælgelse. Dette er eksemplificeret ved domesticering af Gram-positive bakterie B. subtilis, som bruges på verdensplan i grundforskning og i industrien. I 1940’erne B. subtilis blev behandlet med DNA-skadelige røntgenstråler efterfulgt af dyrkning under en bestemt vækst tilstand⁶. De mutationer, der er akkumuleret i bakterierne under deres domesticering, tegner sig for tabet af mange vækstegenskaber, dvs.

I dag, for de bedst studerede modelbakterier Escherichia coli og B. subtilis, er en række kraftfulde værktøjer tilgængelige for genetisk at manipulere deres genomer for at løse specifikke videnskabelige spørgsmål. Nogle gange forårsager inaktivering af et interessegen en alvorlig vækstfejl, som derefter er tydeligt synlig på standardvækstmedium⁹. I modsætning hertil ignoreres mutationer, der forårsager en svag vækstfejl og dermed kun lidt påvirker belastningens egnethed, ofte. Men i begge tilfælde resulterer langvarig inkubation og passaging af mutantstammerne i flere generationer normalt i akkumulering af suppressor mutanter, der har genoprettet fænotypen af moderstammen^2,9. Karakteriseringen af suppressor mutanter og identifikationen af de mutationer, der har genoprettet vækstfejlen i den overordnede mutantstamme, er en meget nyttig tilgang, der tillader belysning af vigtige og ofte nye cellulære processer^10,11.

Vi er interesseret i kontrollen med glutamathomøostase i B. subtilis¹². I lighed med E. coli, B. subtilis reagerer på turbation af glutamathomøostase (dvs.blok i glutamatforringelse²) ved akkumulering af suppressor mutanter. De genomiske ændringer i disse suppressor mutanter, der blev erhvervet ved spontan mutation, viste sig hurtigt at genoprette glutamathomøostase^9,13. Derfor er det ikke overraskende, at tilpasningen af B. subtilis til en bestemt væksttilstand under domesticering af bakterien afspejles i enzymsyntese og i de udviklede enzymatiske aktiviteter, som er involveret i glutamatmetabolisme¹². Det er blevet antydet, at manglen på eksogen glutamat i vækstmediet under domesticeringsprocessen var drivkraften bag fremkomsten og fikseringen af det kryptiske glutamat dehydrogenase (GDH) gudB^CR-genet i laboratoriestammen 168^2,14. Denne hypotese understøttes af vores observation af, at den reducerede mængde GDH-aktivitet i laboratoriestammen giver bakterierne en selektiv vækstfordel, når eksogen glutamat er knap². Desuden resulterer dyrkning af en B. subtilisstamme, der syntetiserer GDH GudB, i mangel af eksogen glutamat i akkumulering af suppressor mutanter, der har inaktiveret gudB-genet ². Det er klart, at tilstedeværelsen af et katabolisk aktivt GDH er ufordelagtigt for cellen, fordi endogent produceret glutamat, der ellers kunne anvendes til anabolisme, nedbrydes til ammonium og 2-oxoglutarat (figur 1). I modsætning hertil, når glutamat leveres af mediet, har en B. subtilis-stamme udstyret med højt niveau GDH-aktivitet en selektiv vækstfordel i forhold til en stamme, der syntetiserer kun et funktionelt GDH. Det er rimeligt at antage, at GDH-aktivitet på højt niveau gør det muligt for bakterierne at udnytte glutamat som en anden kulstofkilde ud over andre kulstofkilder fra mediet² (se figur 1). Således påvirker GDH-aktivitet stærkt bakteriernes egnethed, afhængigt af tilgængeligheden af eksogen glutamat.

Her præsenterer vi en meget illustrativ metode til at overvåge og visualisere intraspecies konkurrence mellem to B. subtilis stammer, der adskiller sig i en enkelt locus på kromosomet (Figur 2). De to stammer blev mærket med yfp og cfp gener kodning fluorophores YFP og CFP, og cocultivated under forskellige ernæringsmæssige forhold. Ved at udtage prøver over tid og ved at forgylde passende fortyndinger på agarplader kunne de overlevende i hver af kulturerne let overvåges ved hjælp af et fælles stereofluorescensmikroskop. Den procedure, der er beskrevet i dette papir, er let at udføre og egnet til at visualisere den hurtige klonudvidelse og eliminering af henholdsvis gavnlige og skadelige mutationer i en cellepopulation over tid.

Protocol

1. Fremstilling af Agar Plader, Kultur Medier, Cryostocks, og Precultures Forbered vækstmedier og påkrævede reagenser (se tabellen over materialer og reagenser). Stribe B. subtilis stammer(f.eks. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) og BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) udtrykker henholdsvis en og to aktive GDH’er2, der vil blive brugt i konkurrenc…

Representative Results

Den her beskrevne metode blev anvendt med succes til at visualisere intraspecieskonkurrence i en cellepopulation bestående af B. subtilisstammer, der var mærket med henholdsvis den fælles fiskeripolitik og yfp-gener, der kodede henholdsvis fluorophores CFP og YFP. Som vist i figur 3kan metoden bruges til at visualisere intraspecieskonkurrence på en meget illustrativ måde. Ved at spotte prøverne på små områder blev cellepopulationens kloniske sammensætning gjort synlig…

Discussion

Flere metoder er blevet udviklet til at analysere konkurrencedygtige egnethed af bakterier¹⁶. I mange tilfælde bakterierne var mærket med forskellige antibiotikaresistens kassetter¹⁷. I lighed med vores tilgang gør mærkning af cellerne med antibiotikaresistenskassetter det muligt at evaluere bakteriernes konkurrencedygtige egnethed under cocultivation under definerede vækstbetingelser. Desuden kan denne metode bruges til at bestemme konkurrencedygtig egnethed af celler, der adskiller sig fra hi…

Materials

(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746	–
Agar	Difco, USA	214010	–
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714	–
CaCl2	Roth, Germany	5239	–
Glucose	Applichem, Germany	A3617	–
Glycerol	Roth, Germany	4043	–
K2HPO4 x 3 H2O	Roth, Germany	6878	–
KCl	Applichem, Germany	A3582	–
KH2PO4	Roth, Germany	3904	–
KOH	Roth, Germany	6751	–
MgSO4 x 7 H2O	Roth, Germany	P027	–
MnCl2	Roth, Germany	T881	–
MnSO4 x 4 H2O	Merck Millipore, Germany	102786	–
NaCl	Roth, Germany	9265	–
Nutrient broth	Roth, Germany	X929	–
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712	–
Tryptone	Roth, Germany	8952	–
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445	–
Yeast extract	Roth, Germany	2363	–
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001	–
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691	–
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001	–
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473	–
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742	–
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22	–
with aluminium caps
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24	–
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23	–
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012	–
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,	–
		4910 000.042,
		4910 000.069
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425	–
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440	–
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21	–
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000	–
Freezer (-20 and -80 °C)	–	–	–
Fridge (4 °C)	–	–	–
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	–	–
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766	–
Vortex	Vortex  3, IKA, Germany	3340000	–
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by	–
		CPA2202S
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9	–
Powerpoint program	Microsoft, USA	–	–
Office Excel program	Microsoft, USA	–	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	–	–
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4 x 7 H2O
1 g KCl
if required, add 15 g agar for solid SP medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
if required, add 15 g agar for solid LB medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
CE-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4 x 3 H2O
16.5 g (NH4)2SO4
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4 x 4 H2O
12.3 g MgSO4 x 7 H2O
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) solution
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)			Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)