Övervakning av intraspecieskonkurrens i en bakteriecellpopulation genom kokultivering av fluorescerande märkta stammar

Summary

Bakterier kan ackumulera antingen skadliga eller fördelaktiga mutationer under sin livstid. I en population av celler individer som har ackumulerat fördelaktiga mutationer kan snabbt konkurrera ut sina kamrater. Här presenterar vi ett enkelt förfarande för att visualisera intraspecies konkurrens i en bakteriell cellpopulation över tid med fluorescerande märkta individer.

Abstract

Många mikroorganismer som bakterier förökar sig extremt snabbt och populationerna kan nå höga celltätheter. Små fraktioner av celler i en population har alltid ackumulerade mutationer som antingen är skadliga eller fördelaktiga för cellen. Om fitness effekten av en mutation ger subpopulationen en stark selektiv tillväxt fördel, individerna av denna subpopulation kan snabbt konkurrera ut och även helt eliminera sina omedelbara kamrater. Således kan små genetiska förändringar och urvalsdriven ackumulering av celler som har förvärvat fördelaktiga mutationer leda till en fullständig förskjutning av genotypen av en cellpopulation. Här presenterar vi ett förfarande för att övervaka den snabba klonurvalet expansion och eliminering av fördelaktiga respektive skadliga mutationer, i en bakteriell cellpopulation över tiden genom kokultivering av fluorescerande märkta individer av Gram-positiv modellbakterien Bacillus subtilis. Metoden är lätt att utföra och mycket belysande att visa intraspecies konkurrens bland individerna i en bakteriecellpopulation.

Introduction

Jordbakterier är vanligtvis utrustade med flexibla regleringsnätverk och bred metabolisk kapacitet. Båda funktionerna gör det möjligt för cellerna att justera sina katabola och anabola vägar för att konkurrera med sina kamrater och andra mikroorganismer för näringsämnena, som finns i en given ekologisk nisch¹. Men om bakterierna inte kan anpassa sig till sin miljö kan andra mekanismer stå för en art överlevnad. Faktum är att eftersom många bakterier förökar sig snabbt och populationerna kan nå höga celltätheter subpopulationer kan spontant ha ackumulerade fördelaktiga mutationer som ger cellerna en selektiv tillväxtfördel och därför öka deras kondition. Dessutom kan mutationella hotspots och stressinducerad adaptiv mutagenes underlätta utvecklingen av en maladapterad bakterie^2,3. Således är ackumulering av mutationer och tillväxt under kontinuerligt urval ursprunget för den enorma mikrobiella mångfalden, även inom samma släkte^4,5. Liksom i naturen förekommer formning av bakteriella genom också i laboratoriet på grund av kontinuerlig odling under urval. Detta exemplifieras av domesticeringen av grampositiva bakterien B. subtilis, som används över hela världen inom grundforskning och industri. På 1940-talet behandlades B. subtilis med DNA-skadliga röntgenstrålar följt av odling under ett specifikt tillväxttillstånd⁶. Mutationerna som har ackumulerats i bakterierna under domesticeringen står för förlusten av många tillväxtegenskaper, dvs. B. subtilis laboratoriestam 168 förlorade förmågan att bilda komplexa kolonier^7,8.

Nuförtiden, för de bäst studerade modellbakterierna Escherichia coli och B. subtilis, finns en mängd kraftfulla verktyg tillgängliga för att genetiskt manipulera deras genom för att ta itu med specifika vetenskapliga frågor. Ibland orsakar inaktiveringen av en gen av intresse en allvarlig tillväxtdefekt, som sedan tydligt syns på standardtillväxtmedium⁹. Däremot ignoreras ofta mutationer som orsakar en svag tillväxtdefekt och därmed bara något påverkar stammens kondition. I båda fallen leder dock långvarig inkubation och passaging av mutanta stammar i flera generationer vanligtvis till ackumulering av suppressor mutanter som har återställt fenotyp av^{moderstammen 2,9}. Karakteriseringen av suppressormutanter och identifieringen av mutationerna som har återställt tillväxtdefekten hos den överordnade mutantstammen är ett mycket användbart tillvägagångssätt som möjliggör klargörande av viktiga och ofta nya cellulära^{processer 10,11}.

Vi är intresserade av kontrollen av glutamat homeostas i B. subtilis¹². I likhet med E. colisvarar B. subtilis på stör av glutamathomeostas (dvs.block i glutamatnedbrytning²) genom ackumulering av suppressormutanter. Genomiska förändringar i dessa suppressor mutanter som förvärvades av spontan mutation visade sig snabbt återställa glutamat homeostas^9,13. Därför är det inte förvånande att anpassning av B. subtilis till ett specifikt tillväxttillstånd under domesticering av bakterien speglas i enzymsyntesen och i de utvecklade enzymatiska aktiviteterna, som är involverade i glutamatmetabolism¹². det har föreslagits att bristen på exogen glutamat i tillväxtmediet under domesticeringsprocessen var drivkraften för uppkomsten och fixeringen av den kryptiska glutamat dehydrogenas (GDH) gudB^{CR genen} i laboratoriestammen 168^2,14. Denna hypotes stöds av vår observation att den minskade mängden GDH-aktivitet i laboratoriestammen ger bakterierna en selektiv tillväxtfördel när exogen glutamat är knapp². Dessutom resulterar odling av en B. subtilis stam, som syntetiserar GDH GudB, i avsaknad av exogen glutamat i ackumulering av suppressor mutanter som har inaktiverat gudB ^{genen 2}. Uppenbarligen är närvaron av en katabolt aktiv GDH ofördelaktig för cellen eftersom endogent producerade glutamat som annars skulle kunna användas för anabolism bryts ned till ammonium och 2-oxoglutarat (Figur 1). När glutamat tillhandahålls av mediet har däremot en B. subtilisstam utrustad med GDH-aktivitet på hög nivå en selektiv tillväxtfördel jämfört med en stam som bara syntetiserar en funktionell GDH. Det är rimligt att anta att GDH-aktivitet på hög nivå gör det möjligt för bakterierna att använda glutamat som en andra kolkälla utöver andra kolkällor som tillhandahålls av^{mediet 2} (se figur 1). Således påverkar GDH-aktivitet starkt bakteriernas kondition, beroende på tillgången på exogen glutamat.

Här presenterar vi en mycket belysande metod för att övervaka och visualisera intraspecies konkurrens mellan två B. subtilis stammar som skiljer sig åt i en enda locus på kromosomen (Figur 2). De två stammarna var märkta med yfp- och cfp-generna som kodade fluorforerna YFP och CFP och kokultiverade under olika näringsförhållanden. Genom provtagning över tid och genom plätering av lämpliga utspädningar på agarplattor kan de överlevande i var och en av kulturerna enkelt övervakas med hjälp av ett gemensamt stereofluorescensmikroskop. Förfarandet som beskrivs i detta dokument är lätt att utföra och lämpligt att visualisera den snabba klonurformiga expansionen och eliminering av fördelaktiga och skadliga mutationer, respektive i en cellpopulation över tid.

Protocol

1. Förberedelse av Agarplattor, Kulturmedia, Kryostockar och Prekulturer Förbered tillväxtmedier och erforderliga reagenser (se tabell över material och reagenser). Strimlar B. subtilis-stammarna (t.ex. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) och BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) uttrycker en respektive två aktiva GDH:er) 2 som kommer att användas…

Representative Results

Metoden som beskrivs här tillämpades framgångsrikt för att visualisera intraspecies konkurrens i en cellpopulation bestående av B. subtilis stammar som var märkta med cfp och yfp gener kodning fluorophores CFP respektive YFP. Som visas i figur 3kan metoden användas för att visualisera intraspecieskonkurrens på ett mycket belysande sätt. Genom att upptäcka proverna på små områden gjordes cellpopulationens klonursammansättning synlig i korthet. Även om detta tillv…

Discussion

Flera metoder har utvecklats för att analysera konkurrenskraftig kondition hos bakterier¹⁶. I många fall var bakterierna märkta med olika antibiotikaresistenskassetter¹⁷. I likhet med vårt tillvägagångssätt möjliggör märkning av cellerna med antibiotikaresistenskassetter utvärdering av bakteriernas konkurrenskraftiga kondition under kokultivering under definierade tillväxtförhållanden. Dessutom kan denna metod användas för att bestämma konkurrenskraftig kondition hos celler som skil…

Materials

(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746	–
Agar	Difco, USA	214010	–
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714	–
CaCl2	Roth, Germany	5239	–
Glucose	Applichem, Germany	A3617	–
Glycerol	Roth, Germany	4043	–
K2HPO4 x 3 H2O	Roth, Germany	6878	–
KCl	Applichem, Germany	A3582	–
KH2PO4	Roth, Germany	3904	–
KOH	Roth, Germany	6751	–
MgSO4 x 7 H2O	Roth, Germany	P027	–
MnCl2	Roth, Germany	T881	–
MnSO4 x 4 H2O	Merck Millipore, Germany	102786	–
NaCl	Roth, Germany	9265	–
Nutrient broth	Roth, Germany	X929	–
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712	–
Tryptone	Roth, Germany	8952	–
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445	–
Yeast extract	Roth, Germany	2363	–
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001	–
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691	–
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001	–
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473	–
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742	–
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22	–
with aluminium caps
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24	–
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23	–
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012	–
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,	–
		4910 000.042,
		4910 000.069
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425	–
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440	–
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21	–
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000	–
Freezer (-20 and -80 °C)	–	–	–
Fridge (4 °C)	–	–	–
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	–	–
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766	–
Vortex	Vortex  3, IKA, Germany	3340000	–
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by	–
		CPA2202S
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9	–
Powerpoint program	Microsoft, USA	–	–
Office Excel program	Microsoft, USA	–	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	–	–
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4 x 7 H2O
1 g KCl
if required, add 15 g agar for solid SP medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
if required, add 15 g agar for solid LB medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
CE-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4 x 3 H2O
16.5 g (NH4)2SO4
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4 x 4 H2O
12.3 g MgSO4 x 7 H2O
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) solution
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)			Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)