סינתזה של חלבון מלאכותי בתיווך intein Hydrogel
Summary
אנו מציגים את הסינתזה של הידרוג'ל-תיווך intein פיצול חלבון. אבני הבניין של הידרוג'ל הזה הוא שני קופולימרים חלבון המכילים כל מקטע של חלבון trimeric המשמש כcrosslinker וחצי אחד של intein מפוצלת. ערבוב של שני קופולימרים החלבון מעורר תגובת טרנס שחבור intein, מניב יחידת פוליפפטיד שעצמי מרכיבה לתוך הידרוג'ל. הידרוג'ל זו משלבת חלבונים כדוריים מאוד פונקציונליים pH והטמפרטורה יציבה, תואם עם ממסים אורגניים, ובקלות.
Abstract
אנו מציגים את הסינתזה של חלבון הידרוג'ל מאוד יציב בתיווך תגובת טרנס שחבור-זרז intein פיצול חלבון. אבני הבניין של הידרוג'ל זה שני בלוק קופולימרים חלבון המכילים כל מקטע של חלבון trimeric המשמש כcrosslinker וחצי אחד של intein מפוצלת. סליל אקראי הידרופילי מאוד מוכנס לתוך אחד מבלוק קופולימרים להחזקת מים. ערבוב של שני קופולימרים לחסום חלבון מעורר תגובת טרנס שחבור intein, מניב יחידת פוליפפטיד עם crosslinkers בכל צד שמהירות עצמי מרכיב להידרוג'ל. הידרוג'ל זה מאוד יציב תחת שני תנאים חומציים ובסיסיים, בטמפרטורות של עד 50 מעלות צלזיוס, ובממסים אורגניים. הידרוג'ל במהירות רפורמות לאחר קרע מושרה גזירה. התאגדות של "פפטיד תחנת עגינה" לאבן בניין הידרוג'ל מאפשרת שילוב נוח של "חלבון עגינה" מתויג חלבוני יעד.הידרוג'ל תואם תקשורת צמיחה בתרבית רקמה, תומך בדיפוזיה של מולקולות 20 kDa, ומאפשר הקיבוע של חלבונים כדוריים ביו. היישום של הידרוג'ל חלבון intein בתיווך כbiocatalyst אורגני ממס תואם הודגם על ידי המתמצת את אנזים peroxidase חזרת והאימות את פעילותה.
Introduction
הידרוג עשוי כולו מחלבונים לשאת הפוטנציאל לקדם באופן משמעותי תחומים מגוונים כמו הנדסת רקמות, אספקת הסמים וbiofabrication 1. הם מציעים יתרונות על פני הידרוג פולימר סינטטי מסורתי כולל התאמה ביולוגית ואת הפוטנציאל לתמוך שילוב של חלבונים כדוריים ביו noninvasively.
בעבודה זו, אנו מתארים את הפיתוח של הידרוג'ל חלבון חדש שנוצר באמצעות תגובה-תיווך intein פיצול חלבון טרנס שחבור ויישומה כפיגום קיבוע חלבון (איור 1). אבני הבניין להידרוג'ל זה שני בלוק קופולימרים חלבון בכל המרכיבים את שבר N-או C-המסוף של פיצול intein (IN וIC) ומקטע של חלבון crosslinker Multimeric. DnaE intein מpunctiforme Nostoc (NPU) שימש כפיצול intein 2,3 וחלבון קטן trimeric (12 KDA) CutA מPyrococcus horikoshii </ Em> שימש כ4,5 חלבון crosslinker. הם הצטרפו crosslinkers שונה באמצעות תגובת טרנס שחבור זרז intein, מה שמוביל להיווצרות של רשת crosslinked מאוד חלבון (הידרוג'ל). intein NPU נבחרה בגלל קינטיקה שלה תגובה מהירה (t 1/2 = 63 שניות) ותשואה גבוהה טרנס שחבור (קרוב ל80%) 2,3. חלבון CutA נבחר כcrosslinker בשל היציבות הגבוהה שלה. יש לי trimers CutA טמפרטורת denaturation של ליד 150 ° C ולשמור על מבנה של הרביעון trimeric בפתרונות המכילים ככל 5 M hydrochloride guanidine 4,6. מאז החלפת מקטע בין crosslinkers השונים היא תורם עיקרי לשחיקת משטח הידרוג'ל הפיזי 7, האינטראקציה מקטע היתר חזקה מאוד בCutA צריכה להרתיע חילופי מקטע כזה, מה שמוביל להידרוג'ל יציב יותר. אחת מאבני הבניין הללו מכיל גם פפטיד S-בר הידרופילי מאוד כפי שאמצע הבלוק כדי להקל על מיםשמירה 8.
ערבוב של שני אבני בניין הידרוג'ל יוזם תגובת טרנס שחבור בין IN וIC intein ברים, יצירת שרשרת פוליפפטיד כבר עם crosslinkers בשני המסופים. Crosslinkers מיחידות מולקולריות כגון מרובות לתקשר אחד עם השני, ויוצר רשת crosslinked מאוד הידרוג'ל (איור 1 א). "פפטיד עגינה תחנה" ספציפי (DSP) הוא שולב אחד מאבני בניין הידרוג'ל כדי להקל על קיבוע יציב של "חלבון עגינה" (DP), מתויג חלבון המטרה להידרוג'ל. השימוש בפיצול intein לתווך ההרכבה הידרוג'ל לא רק מספק גמישות נוספת לסינתזת הידרוג'ל החלבון, אלא גם מאפשר צפיפות גבוהה, טעינה אחידה של חלבון המטרה לאורך כל הידרוג'ל, כמו חלבוני היעד נטענים לפני היווצרות הידרוג'ל.
הידרוג'ל החלבון בתיווך intein הוא STA מאודble בתמיסה מימית עם מעט לשחיקה לא לגילוי לאחר 3 חודשים בטמפרטורת חדר. יציבות נשמרת במגוון רחב של PHS (6-10) וטמפרטורות (4-50 מעלות צלזיוס), והידרוג'ל הוא גם תואם עם ממסים אורגניים. הידרוג'ל זה משמש לקיבוע של שני חלבונים כדוריים: החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) והחזרה peroxidase (HRP). הידרוג'ל הכולא החלבון האחרון משמש לבצע biocatalysis בממס אורגני.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה זו, שהדגמנו את הסינתזה של חלבון הידרוג'ל intein תיווך מאוד יציב. השימוש בפיצול intein מאפשר הידרוג'ל להיווצר בתנאים בתגובה לערבוב של שני מרכיבי נוזל שלב. באופן ספציפי, פיצול intein קוולנטית מחבר בין שני אבני בניין נוזל שלב באמצעות תגובת טרנס שחבור, מניב יחידת פ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ד"ר דוד Tirrell (קלטק) למתנה מסוגו של פלסמיד pQE9 AC 10 12 Atrp, ד"ר טום מויר (אוניברסיטת פרינסטון) למתנה מסוגו של פלסמיד 11 KanR-IntRBS-NpuNC-CFN, ד"ר Takehisa מאטסודה (קאנאזאווה מכון טכנולוגי, האקאסאן, אישיקאווה, יפן) למתנה מסוגו של פלסמיד pET30-CutA-Tip1 10, וד"ר ג'יי ד Keasling (UC ברקלי) למתנה מסוגו של פלסמיד 13 pJD757 . עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע הקריירה, חיל האוויר האמריקאי ייפ ונורמן הקמן מתקדם תכנית המחקר.
Materials
|
Name |
Company |
Catalog Number |
Comments |
|
Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs |
M0530S |
|
|
Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs |
C2527I |
|
|
Luria Bertani |
VWR |
90003-350 |
|
|
Bacto Agar Media |
VWR |
||
|
kanamycin sulfate |
VWR |
||
|
IPTG |
VWR |
EM-5820 |
|
|
Imidazole |
VWR |
EM-5720 |
|
|
Urea |
VWR |
EM-9510 |
|
|
Dithiothreitol (DTT) |
Fisher |
BP172-5 |
|
|
Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science |
11836153001 |
|
|
DPBS |
VWR |
82020-066 |
|
|
Brilliant Blue R |
Acros Organics |
A0297990 |
|
|
Sodium Azide |
Fisher |
AC190380050 |
Caution, highly toxic |
|
Horseradish peroxidase |
Sigma |
P8125-5KU |
|
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher |
AC408460250 |
Caution, highly toxic |
|
phenol |
Fisher |
AC149340500 |
Caution, highly toxic |
|
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher |
AC180340050 |
Caution, highly toxic |
|
n-heptane |
Acros Organics |
120340010 |
|
| [header] | |||
|
Shaker/Incubator |
Fisher Scientific |
Max Q 6000 |
|
|
Centrifuge |
Sorvall |
RC 6 |
|
|
Sonicator |
QSonica |
Misonix 200 |
|
|
Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra |
UFC903024 |
|
|
Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5248-01 |
|
|
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5156-01 |
|
|
Plate reader |
Molecular Devices |
SpectraMax Gemini EM |
Riferimenti
- Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
- Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
- Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
- Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
- Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochimica. 47, 721-730 (2008).
- Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C.. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
- Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
- McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
- Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
- Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
- Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
- Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
- Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
- Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
- Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
- Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
- Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
- Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
- Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).
