Synthese einer Intein-vermittelten Protein-Hydrogel Künstliche

Summary

Wir stellen die Synthese eines Split-Intein-vermittelten Protein-Hydrogel. Die Bausteine ​​dieser Hydrogel zwei Copolymeren, die jeweils eine Protein-Untereinheit eines trimeren Protein, das als Vernetzer und eine Hälfte eines getrennten Inteins dient enthält. Das Mischen der beiden Protein-Copolymere löst eine Intein Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid Einheit, die Selbstorganisation zu einem Hydrogel. Dieses Hydrogel ist stark pH-und temperaturstabil mit organischen Lösungsmitteln kompatibel sind und leicht integriert funktionellen globulären Proteinen.

Abstract

Wir präsentieren die Synthese eines hochstabilen Protein-Hydrogel von einem Split-Intein-katalysierte Protein Transspleißreaktion vermittelt. Die Bausteine ​​dieser Hydrogel zwei Protein-Blockcopolymere jeweils eine Untereinheit eines trimeren Protein, das als Vernetzer und eine Hälfte eines getrennten Inteins dient enthält. Ein stark hydrophiler Zufallsspule in einem der Blockcopolymere für die Wasserrückhaltung eingesetzt. Mischen der beiden Protein-Blockcopolymere löst eine Intein Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid mit Vernetzern Einheit an jedem Ende, die schnell Selbstorganisation zu einem Hydrogel. Dieses Hydrogel ist sehr stabil unter sauren und basischen Bedingungen bei Temperaturen bis zu 50 ° C, und in organischen Lösungsmitteln. Das Hydrogel rasch Reformen nach scherinduzierten Bruch. Einbau einer "Dockingstation Peptid" in das Hydrogel Baustein ermöglicht die komfortable Einbindung von Tagged-Zielproteine ​​"Docking-Protein".Das Hydrogel wird mit Gewebekulturwachstumsmedium kompatibel ist, unterstützt die Diffusion von 20 kDa Moleküle und ermöglicht die Immobilisierung von bioaktiven globulären Proteinen. Die Anwendung der Intein-vermittelten Protein-Hydrogel nach einem organischem Lösungsmittel kompatibel Biokatalysator wurde durch Einkapseln des Meerrettich-Peroxidase-Enzym und erhärten seine Aktivität nachgewiesen.

Introduction

Hydrogele ganz aus Proteinen tragen das Potenzial, die so unterschiedlichen Bereichen wie Tissue Engineering, Drug Delivery und biofabrication ^ein deutlich voranzubringen. Sie bieten Vorteile gegenüber herkömmlichen synthetischen Polymer Hydrogele einschließlich Biokompatibilität und das Potenzial, nicht-invasiv unterstützt den Einbau von Kugelstern bioaktiven Proteinen.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Entwicklung einer neuen Protein-Hydrogel über eine Split-Intein-vermittelten Protein Transspleißreaktion und seine Anwendung als ein Protein Immobilisierung Gerüst (1) ausgebildet ist. Die Bausteine ​​für diese Protein-Hydrogel zwei Blockcopolymeren, die jeweils den N-oder C-terminales Fragment eines getrennten Inteins (IN und IC) und einer Untereinheit eines multimeren Proteins Vernetzer. Die DnaE Intein aus Nostoc punctiforme (Npu) wurde als Splitinteins ^2,3 und einem kleinen trimere Protein (12 kDa) CUTA aus Pyrococcus horikoshii <verwendet/ Em> wurde als Vernetzer Protein ^4,5 verwendet. Verschiedene Vernetzer werden durch Intein katalysiert Transspleißreaktion verbunden, was zur Bildung eines stark vernetzten Proteinnetzwerk (Hydrogel). Npu Intein wurde wegen seiner schnellen Reaktionskinetik (t _1/2 = 63 sec) und hohe trans-Spleißen Ausbeute (fast 80%) ^2,3 gewählt. Die CUTA Protein wurde als Vernetzungsmittel aufgrund seiner hohen Stabilität ausgewählt. CUTA Trimere eine Denaturierungstemperatur in der Nähe von 150 ° C und halten trimeren Quartärstruktur in Lösungen, die bis zu 5 M Guanidin-Hydrochlorid ^4,6. Da Wechseleinheit zwischen verschiedenen Vernetzer ist ein wesentlicher Faktor der physischen Hydrogel Oberflächenerosion ^7, sollte die sehr starke Wechselwirkung zwischen den Untereinheiten in CUTA wie Börsen-Untereinheit abhalten, was zu einer stabileren Hydrogel. Einer dieser Bausteine ​​enthält auch eine stark hydrophile Peptid S-Fragment als Mittelblock, um Wasser zu erleichternRetention ^8.

Das Mischen der beiden Hydrogel Bausteine ​​initiiert eine trans-Spleißen Reaktion zwischen dem IN-und IC-Intein-Fragmente, wodurch eine längere Polypeptidkette mit Vernetzer in beiden Terminals. Vernetzer aus mehreren solchen Moleküleinheiten miteinander interagieren, wodurch eine hochvernetzte Hydrogel-Netzwerk (1A). Ein spezifisches "Dockingstation Peptid" (DSP) in einem der Hydrogel-Bausteine ​​enthalten, um stabile Immobilisierung einer markierten Target-Protein in das Hydrogel "Docking-Protein" (DP) zu erleichtern. Die Verwendung eines getrennten Inteins zum Hydrogel Anordnung vermitteln stellt nicht nur zusätzliche Flexibilität für die Protein-Hydrogel-Synthese, sondern ermöglicht auch hoher Dichte, gleichmäßige Belastung des Zielproteins während des gesamten Hydrogel, da die Zielproteine ​​vor der Hydrogelbildung geladen.

Die Intein-vermittelten Protein-Hydrogel ist sehr staBLE in wässriger Lösung mit wenig bis gar keinem nachweisbaren Erosion nach 3 Monaten bei Raumtemperatur. Stabilität in einem weiten pH-Bereich (6-10) und Temperaturen (4-50 ° C) gehalten wird, und das Hydrogel auch mit organischen Lösungsmitteln kompatibel. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) und Meerrettich-Peroxidase (HRP): Dieses Hydrogel wird zur Immobilisierung von zwei globulären Proteinen verwendet. Hydrogel Einschließen des letzteren Proteins verwendet wird, um die Biokatalyse in einem organischen Lösungsmittel durchzuführen.

Protocol

1. Plasmid-Bau HINWEIS: Alle Gene wurden unter Standard-PCR-Reaktionen mit Phusion High-Fidelity DNA Polymerase pro Angaben des Herstellers amplifiziert. Primer für die Klonierung verwendet wurden zuvor 9 beschrieben. Alle Konstrukte sind in Tabelle 1 aufgeführt. Um CUTA-NpuN (N, Tabelle 1) zu generieren: PCR verstärken CUTA und NpuN Gene von Plasmiden pET30-CUTA-Tip1 10 und KanR-IntRBS-NpuNC CFN-11, je…

Representative Results

Ein Schema für Intein-vermittelten Protein-Hydrogel-Bildung ist in Fig. 1A dargestellt. Die Bausteine ​​des Hydrogels sind die Protein-Copolymere CUTA NpuN (N) und NpuC-S-CUTA (C) (Fig. 1A, Tabelle 1). NpuN / C sind die N-/C-fragments der natürlich aufgeteilt DnaE Intein aus Nostoc punctiforme (Npu). CUTA ist eine stabile trimere Protein aus Pyrococcus horikoshii 4,5. Mischen von gereinigtem N und C in Gegenwart des Reduktionsmittels DTT induziert die Bildung v…

Discussion

In dieser Arbeit haben wir gezeigt, die Synthese eines hochstabilen Intein-vermittelten Protein-Hydrogel. Die Verwendung eines getrennten Inteins ermöglicht das Hydrogel bedingt in Antwort auf das Mischen von zwei Flüssigphasen-Komponenten gebildet werden. Insbesondere die Splitinteins kovalent verbindet zwei Flüssigphasen-Bausteine ​​über eine Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid Einheit durch Vernetzung von Einheiten, die wiederum selbst montiert in ein Hydrogel flankiert. Das Mischen induzier…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530S
Competent Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
Luria Bertani	VWR	90003-350
Bacto Agar Media	VWR	90000-760
kanamycin sulfate	VWR	97061-602
IPTG	VWR	EM-5820
Imidazole	VWR	EM-5720
Urea	VWR	EM-9510
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-5
Protease Inhibitor cocktail	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Caution, highly toxic
Horseradish peroxidase	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine	Fisher	AC408460250	Caution, highly toxic
phenol	Fisher	AC149340500	Caution, highly toxic
tert-butyl hydroperoxide	Fisher	AC180340050	Caution, highly toxic
n-heptane	Acros Organics	120340010
			[header]
Shaker/Incubator	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrifuge	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Ultrafiltration Tubes	Amicon Ultra	UFC903024
Ni Sepharose High Performance HisTrap column	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM