Síntesis de una proteína artificial mediada Intein hidrogel

Summary

Se presenta la síntesis de un hidrogel de proteína dividida intein mediada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. La mezcla de los dos copolímeros de proteínas desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido que se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es altamente pH y temperatura estable, compatible con disolventes orgánicos, y fácilmente incorpora proteínas globulares funcionales.

Abstract

Se presenta la síntesis de un hidrogel altamente estable de proteínas mediada por una reacción de trans-empalme proteína dividida inteína catalizada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de bloque de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. Una bobina al azar altamente hidrófilo se inserta en uno de los copolímeros de bloque para la retención de agua. La mezcla de los dos copolímeros de bloques de proteína desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido con agentes de reticulación en cada extremo que rápidamente se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es muy estable bajo condiciones ácidas y básicas, a temperaturas de hasta 50 ° C, y en disolventes orgánicos. El hidrogel rápidamente las reformas después de la ruptura inducida por cizalla. La incorporación de una "estación de acoplamiento peptídico" en el bloque de construcción de hidrogel permite la incorporación conveniente de "proteína de acoplamiento"-etiquetados proteínas diana.El hidrogel es compatible con el medio de crecimiento de cultivo de tejidos, apoya la difusión de moléculas de 20 kDa, y permite la inmovilización de proteínas globulares bioactivos. La aplicación del hidrogel de proteína mediada por inteína-como un biocatalizador compatible con disolventes orgánicos se demostró mediante la encapsulación de la enzima peroxidasa de rábano picante y corroborar su actividad.

Introduction

Los hidrogeles hechos enteramente de las proteínas tienen el potencial para avanzar significativamente campos tan diversos como la ingeniería de tejidos, la administración de fármacos y biofabricación ^1. Ofrecen ventajas sobre hidrogeles poliméricos sintéticos tradicionales, incluyendo la biocompatibilidad y el potencial para apoyar de forma no invasiva la incorporación de proteínas globulares bioactivos.

En este trabajo se describe el desarrollo de una novela de hidrogel de proteína formada por una reacción de trans-empalme proteína dividida intein mediada y su aplicación como un andamio inmovilización de proteínas (Figura 1). Los bloques de construcción para este hidrogel son dos copolímeros de bloque de proteína que comprenden cada uno el fragmento N-o C-terminal de una fracción de intein (EN e IC) y una subunidad de una proteína multimérica reticulante. La inteína DnaE de Nostoc punctiforme (Npu) se utilizó como la división inteína ^2,3 y una pequeña proteína trimérica (12 kDa) CUTA de Pyrococcus horikoshii </ Em> se utilizó como ^4,5 proteína reticulante. Diferentes agentes de reticulación se unen a través de reacción de trans-empalme inteína catalizada, lo que lleva a la formación de una red de proteínas altamente reticulado (hidrogel). Inteína Npu fue elegido debido a su cinética de reacción rápida (t _1/2 = 63 seg) y alto rendimiento trans-empalme (cerca del 80%) ^2,3. La proteína CUTA fue elegido como el agente de reticulación debido a su alta estabilidad. Trímeros CUTA tienen una temperatura de desnaturalización de cerca de 150 ° C y conservan la estructura cuaternaria trimérica en soluciones que contienen tanto como 5 M hidrocloruro de guanidina ^4,6. Desde intercambio de subunidades entre diferentes agentes de reticulación es un contribuyente importante de la erosión de la superficie de hidrogel física ^7, la fuerte interacción entre la subunidad de Cuta debería desalentar este tipo de intercambios de subunidades, lo que lleva a un hidrogel más estable. Uno de estos bloques de construcción también contiene un péptido S-fragmento altamente hidrofílico como la mitad de la cuadra para facilitar aguaretención ^8.

La mezcla de los dos bloques de construcción de hidrogel inicia una reacción de trans-empalme entre el EN y IC inteína fragmentos, la generación de una cadena de polipéptido más largo con agentes de reticulación en ambos terminales. Los reticulantes de múltiples tales unidades moleculares interactúan entre sí, formando una red de hidrogel altamente reticulado (Figura 1A). Una "estación de acoplamiento de péptidos" específica (DSP) se incorpora en uno de los bloques de construcción de hidrogel para facilitar la inmovilización estable de una "proteína de acoplamiento" (DP)-etiquetados proteína diana en el hidrogel. El uso de una fracción de inteína para mediar el ensamblaje de hidrogel no sólo proporciona una flexibilidad adicional para la síntesis de hidrogel de proteína, sino que también permite alta densidad, una carga uniforme de la proteína diana a través de todo el hidrogel, como las proteínas diana se cargan antes de la formación de hidrogel.

La proteína de hidrogel intein mediada es altamente Stables en solución acuosa con poca o ninguna erosión detectable después de 3 meses a temperatura ambiente. Estabilidad es retenido en una amplia gama de pH (6-10) y temperaturas (4-50 ° C), y el hidrogel también es compatible con disolventes orgánicos. Este hidrogel se usa para la inmovilización de dos proteínas globulares: la proteína fluorescente verde (GFP) y la peroxidasa de rábano picante (HRP). Hidrogel atrapando la última proteína se utiliza para realizar la biocatálisis en un disolvente orgánico.

Protocol

1. Construcción de plásmidos NOTA: Todos los genes fueron amplificados bajo reacciones de PCR utilizando Phusion de alta fidelidad de ADN polimerasa según las especificaciones del fabricante. Los cebadores usados ​​para la clonación se han descrito anteriormente 9. Todos los constructos se enumeran en la Tabla 1. Para generar Cuta-NpuN (N, Tabla 1): Amplificar por PCR los genes Cuta y NpuN de plásmidos pET30-cuta-Tip1 …

Representative Results

Un esquema para la formación de hidrogel de proteína intein mediada se presenta en la Figura 1A. Los bloques de construcción de hidrogel son la proteína copolímeros Cuta-NpuN (N) y NPUC-S-cuta (C) (Figura 1A, Tabla 1). NpuN / C son las N-/C-fragments del DnaE dividir naturalmente inteína de Nostoc punctiforme (Npu). Cuta es una proteína trimérica estable de Pyrococcus horikoshii 4,5. La mezcla de purificado N y C en la presencia del agente reductor TDT induce…

Discussion

En este trabajo, hemos demostrado la síntesis de una gran estabilidad de hidrogel de proteína intein mediada. El uso de una fracción de inteína permite el hidrogel que se forme condicionalmente en respuesta a la mezcla de dos componentes en fase líquida. En concreto, la división inteína covalente une dos bloques de construcción en fase líquida a través de una reacción de trans-empalme, produciendo una unidad polipéptido flanqueada por unidades de reticulación que a su vez auto se ensambla en un hid…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530S
Competent Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
Luria Bertani	VWR	90003-350
Bacto Agar Media	VWR	90000-760
kanamycin sulfate	VWR	97061-602
IPTG	VWR	EM-5820
Imidazole	VWR	EM-5720
Urea	VWR	EM-9510
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-5
Protease Inhibitor cocktail	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Caution, highly toxic
Horseradish peroxidase	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine	Fisher	AC408460250	Caution, highly toxic
phenol	Fisher	AC149340500	Caution, highly toxic
tert-butyl hydroperoxide	Fisher	AC180340050	Caution, highly toxic
n-heptane	Acros Organics	120340010
			[header]
Shaker/Incubator	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrifuge	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Ultrafiltration Tubes	Amicon Ultra	UFC903024
Ni Sepharose High Performance HisTrap column	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM