Medição dos Efeitos de bactérias em<em> C. Elegans</em> Comportamento Usando um Retenção Ensaio Egg

Summary

Um ensaio ovo-in-worm (EIW) é um método útil para quantificar o comportamento de postura. Alterações na postura de ovos pode ser uma resposta comportamental do organismo modelo<em> Caenorhabditis elegans</em> A substâncias ambientais potencialmente prejudiciais, tais como os produzidos por bactérias patogénicas.

Abstract

C. elegans comportamento de postura de ovos é afetado por estímulos ambientais, como a osmolaridade ¹ e vibração ^2. Na ausência total de alimentos C. elegans também deixará postura de ovos e manter ovos fertilizados em sua ³ útero. No entanto, o efeito de diferentes fontes de alimentos, especialmente bactérias patogénicas e, particularmente, Enterococcus faecalis, sobre o comportamento de postura não está bem caracterizado. O ensaio in ovo sem-fim (EIW) é uma ferramenta útil para quantificar os efeitos de diferentes tipos de bactérias, neste caso E. faecalis, sobre o comportamento de postura.

EIW ensaios envolvem a contagem do número de ovos retidos no útero de C. elegans ^4. O ensaio EIW envolve branqueamento encenado, grávida adulto C. elegans para remover a cutícula e separar os ovos retidos do animal. Antes do branqueamento, os vermes são expostos a bactérias (ou qualquer tipo de sinalização ambiental) Por um período fixo de tempo. Após o branqueamento, é muito facilmente capaz de contar o número de ovos retidos no interior do útero dos vermes. Neste ensaio, a um aumento na retenção quantificável de ovos após E. exposição faecalis pode ser facilmente medido. O ensaio EIW é um ensaio comportamental que poderia ser utilizado para rastrear para bactérias potencialmente patogénicos ou a presença de toxinas ambientais. Além disso, o ensaio EIW pode ser uma ferramenta para o rastreio de fármacos que afectam a sinalização de neurotransmissores, pois o comportamento de postura é modulada por neurotransmissores, tais como serotonina e acetilcolina ^5-9.

Introduction

Caenorhabditis elegans, um microscópico, lombriga de vida livre, é um organismo modelo tradicionalmente usado para estudar os processos de desenvolvimento e de sinalização celular por causa de sua anatomia transparente, o desenvolvimento bem caracterizada, totalmente sequenciado o genoma, em tempo de geração curto, e homologia genética de seres humanos . Mais recentemente, C. elegans tornou-se um organismo modelo no campo da toxicologia ambiental e imunidade inata ^{10, 11.}

Esses vermes hermafroditas auto-fertilização se tornam sexualmente maduros dentro de dois a três dias de incubação do ovo. Durante o seu ciclo de vida, C. elegans passa por quatro estágios larvais (L1-L4), antes de atingir a idade adulta. Um isolado hermafrodita pode produzir, em média, 300 filhotes dentro de três dias de pico de fecundidade. Em reprodutivamente madura C. elegans hermafroditas, os ovos fertilizados são retidos no interior do útero durante várias horas antes de ser colocada. Onúmero normal de ovos armazenados no útero em qualquer momento (durante o pico da fecundidade) situa-se entre dez e quinze ^12. O número de ovos no útero é uma função de ambos, a taxa de produção de ovos e a taxa de postura de ovos. Os ovos fertilizados são expulsos do útero pela contração da musculatura dezasseis vulvares dispostas em torno da abertura da vulva ^13. Neurónios motores específicos do hermafrodita (do HSN) e neurónios motores VC sinapse para os músculos da vulva que afetam a contração muscular e, assim, postura comportamento ^5,7,13,14. Expulsão dos ovos do útero ocorre devido à atividade coordenada de neurônios e músculos.

Culturas de laboratório de C. elegans normalmente são levantadas em uma dieta de não patogênicas de Escherichia coli OP50. No ambiente natural, C. elegans entrar em contacto com uma variedade de fontes de alimentos, tais como as bactérias patogénicas, que podem ser potencialmente prejudiciais. Quando expostos a substâncias nocivas emambiente, C. elegans reter ovos até que o ambiente torna-se mais favorável. Presumivelmente, esta retenção de ovos é um esforço para proteger sua prole.

Neste verme ovo em ensaio (EIW), C. elegans estão expostos às bactérias potencialmente patogénicas, Enterococcus faecalis, que é encontrada no meio ambiente. A exposição a formas patogénicas de E. faecalis pode causar infecção intestinal persistente e até mesmo a morte em C. elegans ^15. A exposição a outras formas de bactérias patogénicas têm demonstrado afectar a retenção de ovo ^16,17, no entanto, o efeito não foi quantificado. Além disso, o efeito de suavemente estirpes patogénicas de E. faecalis, as estirpes que não são imediatamente letal, sobre o comportamento de postura não foi estudado.

EIW ensaios envolvem a contagem do número de ovos retidos no útero de C. elegans ^4. Embora C. eleganssão transparentes, os ovos que se acumulam no útero pode ser difícil de quantificar num animal intacto. O ensaio EIW envolve branqueamento gravídico adulto C. elegans que foram expostos a bactérias, por um período fixo de tempo. A solução de água sanitária dissolve a cutícula externa deixando os ovos para trás. Os ovos são de refracção para os efeitos de branqueamento, devido à presença de uma casca de ovo. Após o branqueamento, é muito facilmente capaz de contar o número de ovos libertados do útero dos vermes após o branqueamento.

O ensaio é descrito um método simples, barato e rápido para quantificar o número de óvulos no útero de uma só vez, e, assim, quantificar os efeitos de E. faecalis sobre retenção de ovo. Este ensaio pode ser utilizado para quantificar o efeito de outros tipos de bactérias, toxinas ou medicamentos ambientais sobre a retenção de ovo. Este ensaio tem também o potencial de ser usada como uma tela para patogenicidade.

Protocol

1) Elaboração de Nematóides Crescimento Mídia (NGM) Para fazer com que as placas 50, adicionar 1,5 g de NaCl, 8,5 g Agar ultrapura, e 1,25 g de peptona de um 1 Lflask. Adicionar 487,5 ml de dH 2 O para o balão. Agite bem para misturar e cobrir abertura do frasco com um pedaço de papel alumínio. Esterilizar a solução por tratamento em autoclave, em condições normalizadas (121 psi, 120 ° C, 20 min.) Deixar a solução arrefecer até 45 ° C num banho de água…

Representative Results

Este ensaio permite a quantificação do número de ovos retidos no interior C. elegans após exposição a E. faecalis. L4 encenado vermes (caracterizados por espaço aberto transparente acima de sua vulva, Figura 1) foram expostos a E. faecalis até a idade adulta. Após 40 horas de exposição a E. faecalis, branqueamento foi realizado. À medida que a cutícula desintegrado na gotícula de lixívia, os ovos se tornou mais evidente (Figura 2). O n?…

Discussion

Os passos mais importantes na realização com êxito neste ensaio são os seguintes: 1) usando stocks bem alimentados de C. elegans, 2) cultura de tipos individuais de bactérias na placa de ensaio, 3) identificação precisão encenado L4 vermes para a exposição a E. faecalis, 4), mantendo o tempo de exposição a E. faecalis consistentes em todos os ensaios e 5) branqueamento tempo não deve exceder 10 minutos para impedir a desintegração do ovo.

Para este e…

Materials

Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for E. faecalis	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
			by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
			all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000