Summary
In-vitro-Assays zur Messung der Virusreplikation wurde durch die Entwicklung von rekombinanten RNA-Viren Luciferase oder andere Enzyme, die Biolumineszenz exprimieren verbessert. Hier werden wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die solche rekombinante Stämme von Masern-und Chikungunya-Viren, um Breitspektrum antiviralen Medikamenten aus chemischen Bibliotheken zu isolieren verbindet.
Abstract
RNA-Viren sind für die wichtigsten Krankheiten wie Grippe, Bronchitis, Dengue-Fieber, Hepatitis C oder Masern verantwortlich. Sie stellen auch eine neue Bedrohung wegen der erhöhten weltweiten Austausch und die menschlichen Populationen durchdringen mehr und mehr natürliche Ökosysteme. Ein gutes Beispiel für eine solche Situation ist Schwellen Chikungunya-Virus-Epidemien von 2005-2006 in den Indischen Ozean. Jüngsten Fortschritte im Verständnis der zellulären Wege Steuern virale Replikation zeigen, dass Verbindungen, die auf Wirtszellfunktionen anstatt das Virus selbst, könnte eine große Gruppe von RNA-Viren hemmen. Einige antiviralen Breitband-Verbindungen mit Host-zielorientierte Tests identifiziert worden. Aber die Hemmung der Virusreplikation in Zellkulturen unter Verwendung von Reduktion der cytopathischen Effekte als Auslese immer noch eine überragende Screening-Strategie. Solche funktionellen Bildschirme wurden durch die Entwicklung von rekombinanten Viren Reporter exprimieren verbesserter Enzyme ca.Pable der Biolumineszenz wie Luciferase. In dem vorliegenden Bericht haben wir detailliert eine Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die rekombinanten Masern-und Chikungunya-Viren mit zellulären Lebensfähigkeitstests kombiniert, um Verbindungen mit einem antiviralen Breitband-Profil zu identifizieren.
Introduction
RNA-Viren sind für eine Vielzahl von Infektionen beim Menschen verantwortlich und haben einen großen Einfluss auf die Bevölkerung weltweit, sowohl in Bezug auf die öffentliche Gesundheit und wirtschaftliche Kosten. Effizienten Impfstoffen gegen verschiedene menschliche RNA-Viren entwickelt worden und werden weithin als prophylaktische Behandlungen. Es besteht jedoch immer noch ein Mangel an kritischen therapeutische Arzneimittel gegen RNA-Virus-Infektionen. Tatsächlich sind effiziente Impfstoffe nicht verfügbar gegen wichtige menschliche Krankheitserreger wie Dengue-Virus, Hepatitis-C-Virus oder humanen Respiratory-Syncytial-Virus (HRSV). Außerdem sind RNA-Viren, die für die Mehrheit der neu auftretenden Krankheiten, die in der Frequenz wegen der globalen Austausch und menschlichen Auswirkungen auf ökologische Systeme erhöht haben verantwortlich. Gegen diese Bedrohung, die RNA-Viren darstellen, ist unser therapeutisches Arsenal äußerst begrenzt und relativ ineffizient 1-3. Gegenwärtige Therapien beruhen im wesentlichen auf rekombinanten Typ I-Interferone (IFN-α / β), um angeborene Immunität stimulieren basiert,oder die Verabreichung von Ribavirin. Obwohl die Wirkungsweise dieser Ribonukleosid analogen umstritten ist und wahrscheinlich von mehreren Mechanismen, der Hemmung der zellulären IMPDH (Inosin-Monophosphat-Dehydrogenase), die die intrazelluläre GTP-Pools erschöpft ist eindeutig erforderlich 4. Ribavirin in Kombination mit pegyliertem IFN-α, ist die Haupt Behandlung gegen Hepatitis C-Virus. Allerdings sind die relativ geringe Wirksamkeit in vivo gegen die meisten RNA-Viren IFN-α / β und Ribavirin Behandlungen, wie sie effizient stumpfen IFN-α / β Signaltransduktion durch Expression von Virulenzfaktoren 5 und oft entkommen Ribavirin 3. Dieser Mehr der Tatsache, dass Ribavirin Behandlung wichtiger Fragen Toxizität erhöhen, obwohl es vor kurzem gegen schwere Krankheit mit HRSV umstrittene Vorteile 6 genehmigt wurde. In jüngerer Zeit sind einige virusspezifischen Behandlungen wurden vermarktet, insbesondere gegen Influenzavirus mit der Entwicklung of Neuraminidase-Hemmer 3. Die große Vielfalt und dauerhafte Auftreten von RNA-Viren verhindert jedoch die Entwicklung von spezifischen Behandlungen gegen jeden von ihnen in relativ naher Zukunft. Insgesamt unterstreicht dies die Notwendigkeit für eine effiziente Strategien, um in der nahen Zukunft zu identifizieren und zu entwickeln, starke antivirale Moleküle.
Es ist trivial zu sagen, dass ein Breitspektrum-Inhibitor aktiv gegen eine große Gruppe von RNA-Viren würde dieses Problem lösen. Obwohl ein solches Molekül ist immer noch ein Virologe Traum, unser besseres Verständnis der zellulären Abwehrmechanismen und angeborene Immunsystem nahe, dass einige Möglichkeiten gibt es 7,8. Mehrere akademischen und industriellen Laboratorien versuchen nun, Moleküle, die bestimmte Aspekte der zellulären Abwehrmechanismen oder Stoffwechselwege, die virale Replikation stumpf zu stimulieren. Obwohl solche Verbindungen wahrscheinlich zeigen erhebliche Nebenwirkungen, werden Behandlungen gegen akute Virusinfektionen zu verabreichened für eine relativ kurze Zeit, so dass sie trotz einer möglichen Toxizität auf lange Sicht akzeptabel. Verschiedene Strategien wurden entwickelt, um solche Breitspektrum-antiviralen Moleküle zu identifizieren. Einige Forschungsprogramme zielen auf die Suche nach Molekülen, die spezifische Abwehr oder Stoffwechselwege abzielen. Dazu gehören zum Beispiel Krankheitserreger Erkennungsrezeptoren auf eine antivirale Genexpression 9 entlocken und aktivieren antiviralen Faktoren wie RNaseL 10, Autophagie Maschinen Virus Abbau 11 zu fördern, Nucleosidsynthese Pfade 12,13, oder apoptotischen Kaskaden zum Tod von Virus-infizierten Zellen ausfallen 14. Andere Gruppen haben phänotypische Bildschirme, die nicht ziel basieren 13,15-17 entwickelt. In diesem Fall werden die antivirale Moleküle einfach durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, um die virale Replikation in einem gegebenen zellularen Systems blockieren. Die allgemeine Annahme ist, dass eine Verbindung Hemmung 2-3 unabhängigen RNA-Viren wäre ein geeignetes Profil für eine breit spectrum antiviralen Moleküls. Die Wirkungsweise der Trefferverbindungen mit einer solchen empirischen Ansatz gewählt wird erst in einem zweiten Zeitpunkt bestimmt und schließlich kann die Identifizierung von neuartigen zellulären Ziele für antivirale Medikamente führen. Interessant ist, dass eine retrospektive Analyse der von der US Food and Drug Administration zwischen 1999 und 2008 zugelassenen neuen Medikamenten hat gezeigt, dass im Allgemeinen, wie phänotypischen Screenings tendenziell besser als zielorientierte Ansätze durchführen, um first-in-class, niedermolekulare Medikamente 18 entdecken .
Virusreplikation in Hochdurchsatz-Assays auf Zellbasis wird in der Regel von Virus zytopathische Effekte bestimmt. Zellen infiziert und in 96 - oder 384-Well-Platten in Gegenwart der getesteten Verbindungen. Nach einigen Tagen werden die Zellschichten fixiert und mit Farbstoffen, wie Kristallviolett gefärbt. Schließlich wird die Absorption mit einem Plattenlesegerät und Verbindungen Hemmung der viralen Replikation durch ihre Fähigkeit identifiziert, die Zellschichten her erhalten bestimmtm-Virus-induzierten zytopathischen Effekt. Alternativ werden viral-vermittelte zytopathischen Effekte mit Standard Lebensfähigkeit Assays wie MTS Reduktion beurteilt. Solche Assays sind hoch handhabbar und kostengünstig, aber leiden unter drei Hauptbeschränkungen. Erstens erfordern sie eine Virus-Zell-Kombination, bei der die virale Replikation ist zytopathischen in nur wenigen Tagen, aber dies ist nicht immer möglich, so fordern alternative Ansätze 19. Zweitens sind sie schlecht quantitative da sie auf einer indirekten Messung der Virusreplikation basiert. Schließlich können toxische Verbindungen wie positive Treffer erzielt werden und müssen daher mit einer Gegen Bildschirm messen Zelllebensfähigkeit beseitigt werden. Um einige dieser Hürden zu überwinden, wurden rekombinante Viren oder Replikons durch reverse Genetik entwickelt worden, Reporterproteine, wie EGFP oder Luciferase exprimieren, aus einer weiteren Transkriptionseinheit oder in Rahmen mit Virusprotein-Gene (einige Beispiele 20-23). Wenn diese Viren replizieren, Reporter proteins zusammen mit viralen Proteine selbst hergestellt. Dies stellt eine sehr quantitative Assay die virale Replikation Messung und Bewertung der inhibitorischen Aktivität des Kandidaten-Moleküle. Dies gilt insbesondere für rekombinante Viren, die Luciferase (oder andere Enzyme, die Biolumineszenz), da dies Reportersystem weist einen weiten Dynamikbereich mit einer hohen Empfindlichkeit und praktisch ohne Hintergrund. Darüber hinaus gibt es keine Anregungslichtquelle, wodurch Interferenzen mit 24 Fluoreszenzverbindung.
Hier haben wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Protokoll auf chemische Bibliotheken für Breitspektrum-Inhibitoren der RNA-Viren zu untersuchen. Die Verbindungen werden zuerst auf menschliche Zellen mit einem rekombinanten Masernvirus (MV) zum Ausdruck Firefly Luziferase 25 (rMV2/Luc, Bild 1, primären Bildschirm) infiziert getestet. MV gehört zu bestellen Mononegavirales und wird oft als eine prototypische Mitglied der Negativstrang RNA-Virus alsEs. Als solches ist MV-Genom als Matrize durch die virale Polymerase verwendet, um mRNA-Molekülen codiert für virale Proteine zu synthetisieren. In dem rekombinanten MV-Stamm genannt rMV2/Luc wird die Luciferase-Expression von einer zusätzlichen Transkriptionseinheit zwischen P und M-Gene (Fig. 2A) einge ausgedrückt. Parallel Verbindungen für ihre Toxizität auf menschlichen Zellen unter Verwendung eines kommerziellen Luciferase-Reagens, das, zur Quantifizierung von ATP getestet, die Anzahl der metabolisch aktiven Zellen in Kultur (Fig. 1, primären Bildschirm). Gesamte chemischen Bibliotheken lassen sich mit diesen beiden Tests, um Verbindungen, die nicht giftig sind und MV-Replikation effizient zu blockieren wählen abgeschirmt werden. Dann werden Treffer für Dosis-Wirkungs-Hemmung der MV-Replikation, das Fehlen von Toxizität als auch für ihre Fähigkeit, Chikungunya-Virus (CHIKV) Replikation (Abbildung 1, sekundären Bildschirm) beeinträchtigen erneut getestet. CHIKV ist ein Mitglied der Familie und Togaviridae sein Genom ist apositive Einzelstrang-RNA-Molekül. Als solches ist es völlig unabhängig von Masern und Verbindungen Hemmung sowohl MV und CHIKV stehen eine große Chance, eine große Gruppe von RNA-Viren hemmen. CHIKV Nicht-Strukturproteine werden von dem viralen Genom übersetzt, während Strukturproteine werden durch Transkription und Translation einer subgenomischen mRNA-Molekül kodiert. Unsere in vitro-Assay für die Replikation CHIKV auf einem rekombinanten Stamm genannt CHIKV / Ren, die Renilla-Luciferase-Enzym als gespaltenen Teil der Nicht-Struktur Polyprotein durch eine Einsetzöffnung des Reportergens zwischen nsP3 und nsP4 Sequenzen 26 (Fig. 2B) auf der Basis drückt. Das Maß der Renilla-Luciferase-Aktivität erlaubt die Überwachung der viralen Replikation in einem frühen Stadium des Lebenszyklus CHIKV.
Das Hochdurchsatz-Protokoll wurde verwendet, um schnell Verbindungen zu identifizieren mit einem geeigneten Profil für Breitspektrum antiviralen Medikamenten in einer kommerziellen Bibliothek von 10.000 MoleModule für die chemische Vielfalt bereichert. Die Verbindungen wurden im Wesentlichen folgende Lipinski-Regel von fünf, mit Molekulargewichten im Bereich von 250 bis 600 Dalton und log D-Werten unter 5. Die meisten dieser Moleküle wurden neue chemische Wirkstoffe in anderen kommerziellen Bibliotheken nicht verfügbar sind.
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Protocol
1. Herstellung von 96-Well-Platten mit Tochter Verbindungen
- Bewegen Mutter 96 Vertiefungen-Platten, die 10 mM Stammlösungen von chemischen Verbindungen in DMSO von -20 ° C bis Raumtemperatur. 5x verdünnen Verbindungen in DMSO Zwischen 96-Well-Platten bei Verdünnung 2 mM zu erhalten. Verdünnung wird durch Pipettieren von 5 &mgr; l in 20 &mgr; l DMSO und Mischen gelöst.
- Je 1 ul von Verdünnungsplatten in trockene Brunnen aus weißem, Barcode-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen. Diese erste Reihe von Tochterplatten (D1) wird verwendet, um die Toxizität der Verbindungen bei einer Endkonzentration von 20 uM zu bewerten. Speicher Tochterplatten bei -20 º C bis zur Verwendung.
- Verdünnen Verbindungen wieder 1.10 durch Pipettieren von 4 ul Verdünnungsplatten in 36 ul DMSO und Mischen. Je 1 ul in trockene Brunnen aus weißen, flachen Boden, Barcode-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen. Diese zweite Gruppe von Tochterplatten (D2) wird verwendet, um die Hemmung der MV replicatio evaluierenn durch die Verbindungen in einer Endkonzentration von 2 uM. Speicher Tochterplatten bei -20 º C bis zur Verwendung.
2. Herstellung von Zellkulturen, um die Verbindung Toxizität ermitteln
- Wachsen HEK-293T-Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit stabilisierten L-Glutamin und 10% fötales Kälberserum (FCS), Streptomycin (100 ug / ml) und Penicillin (100 IU / ml). Die Zellen werden durch Trypsinierung alle 4-5 Tage passagiert und 1:10 verdünnt in einen frischen Kolben. Die Zellen sind in der log-Phase für Experimente sein.
- Am Tag des Experiments zu erholen Zellen durch Trypsinierung und Zellzählung durchzuführen. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren und Resuspendieren sie bei 3 × 10 5 Zellen / ml in Kulturmedium. Auffassung, daß 12,5 ml der Zellsuspension für jedes Abschirmblech erforderlich.
- Über Zellen zu einem Trog, und werden 100 ul Zellsuspension in D1-Platten, die Stachel chemische Zusammensetzungunds. Zellsuspension innerhalb der Wanne wird regelmäßig geschüttelt, um die Sedimentation zu verhindern.
- Spike Kontroll-Wells A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 und G12 mit 1 ul DMSO. Entsprechende Bohrungen werden als Referenz für die lebenden Zellen (keine Toxizität) eingesetzt werden. Spike Kontrollvertiefungen B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 und H12 mit 1 ul DMSO und 2,5 ul einer 0,5% IGEPAL Lösung, um Zellen zu töten. Entsprechende Bohrungen werden als Referenz für die toten Zellen (hohe Toxizität) eingesetzt werden.
- Zellen, Inkubation für 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
3. Herstellung von Zellkulturen durch rMV2/Luc Infizierte
- Wachsen und wieder Zellen, wie in 2.1 und 2.2 beschrieben. Wieder resuspendieren Zellen bei 3 x 10 5 Zellen / ml in Kulturmedium. Auffassung, daß 12,5 ml der Zellsuspension für jedes Abschirmblech erforderlich.
- Optional: Ergänzung Kulturmedium mit Uridin bei 20 ug / ml.
Hinweis: Bei der Kontrolle von chemischen Bibliotheken für virale replication-Inhibitoren scheint es, dass Verbindungen, die auf frühen Schritte der Pyrimidin-Biosynthese werden häufig getrennt 13,16,27,28. Die Zugabe von Uridin Kulturmedium dazu verwendet, um solche antiviralen Moleküle. In der Tat, dies effizient wieder her, wenn die virale Replikation aufwärts Enzyme der Pyrimidin-Biosynthese sind blockiert. - Sparen 01.10 Zellsuspension für Kontrollvertiefungen mit nicht-infizierten Zellen, und fahren Sie mit der Infektion mit Restvolumen.
- Tauen Sie das entsprechende Volumen von rMV2/Luc Stammlösung. MV Stammlösungen sind in der Regel bei 10 6 -10 8 infektiöse Partikel pro ml. Kultur muss mit 0,1 infektiöse Teilchen rMV2/Luc pro Zielzellen, die mit 0,1 Multiplizität der Infektion (MOI) infiziert entspricht. Hinweis: rMV2/Luc von MV-Impfstoff (Schwarz-Stamm) abgeleitet ist und in einer Umgebung BSL2 manipuliert.
- Fügen Sie den Virus auf Zellsuspension und vorsichtig mischen. Übertragen infizierten Zellen zu einem Trog, und werden 100&mgr; l der infizierten Zellsuspension in den Spalten 2 bis 11 der D2-Platten, die Stachel chemischen Verbindungen. Zellsuspension innerhalb der Wanne wird regelmäßig vorsichtig gemischt.
- In den Spalten 1 und 12 werden 100 &mgr; l nicht-infizierten Zellen ein gut auf zwei. Infizierte Zellen werden in den anderen Vertiefungen verteilt.
- Zellen, Inkubation für 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
4. Luciferase Aktivität Maßnahmen und Datenanalyse
- Entfernen D1 Platten aus dem Inkubator, und festzustellen, Zelllebensfähigkeit durch Zugabe von 50 ul Luciferase-basierte Lebensfähigkeit Reagenz direkt an Kultur Brunnen. Mischen und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Lesen Platten mit einem Luminometer. Integrationszeit ist auf 100 ms pro auch gesetzt.
- Entfernen D2 Platten aus dem Inkubator, und bestimmen Sie die Luciferase-Aktivität durch Zugabe von 50 ul der Luciferase-Substrat direkt an Kultur Brunnen. Inkubation für 6 min bei Raumtemperatur, und lesen Platten mit einem Luminometer, wie beschrieüber dem Bett.
- Berechnen Sie einen Z'-Faktor für jede Platte D1 der Toxizität Assay, um die Qualität des Bildschirms 29 zu rechtfertigen. Z '= 1-3 * (σ + σ +-) / (μ + - μ-), wobei μ und σ + + entsprechen mittels Lumineszenz und Standardabweichungen für HEK-293T-Zellen, die mit DMSO allein (keine Toxizität), und μ-und σ-sind mittels Lumineszenz und Standardabweichungen mit IGEPAL behandelt, um Zellen zu töten Kultur Brunnen. Z 'voraussichtlich über 0,5, oder die entsprechende Platte wird verworfen.
- Stellen Toxizität Schwelle bei μ + / 2. Entsorgen Sie Verbindungen mit Lumineszenz-Werte unter diesem Cut-off (Abbildung 3A).
- Berechnen Sie einen Z'-Faktor für jede D2 Platte des antiviralen Test. Hier μ + σ + und entsprechen mittels Lumineszenz und Standardabweichungen für infizierte Zellen mit DMSO allein kultiviert und μ-σ-und sind mittels Lumineszenz und Standardabweichungen für nicht-infizierte Zellen. Auch Platten mit Z & #39; Werte unter 0,5 werden verworfen.
- Berechnen Sie die Hemmung der Virusreplikation wie folgt: Prozentsatz der Hemmung = (μ + - Luciferase-Aktivität für die Verbindung X) / (μ + - μ-) * 100. Stellen Hemmschwelle bei 75%, und wählen Sie Verbindungen, die sowohl reduzieren Lumineszenz-Werte unter diesem Cut-off (3B) und sind nicht giftig nach in 4.4 beschriebenen Kriterien.
5. Sekundärbildschirm Toxizität und Breitspektrum antiviralen Aktivität
- Stellen serielle 1:2 Verdünnungen für jeden Treffer Verbindung in DMSO, ausgehend von 500 um bis 4 um (8 Verdünnungen). Füllen weiß, Barcode-Gewebekulturplatten mit 50 &mgr; l Kulturmedium. 1 ul jeder Verbindung Verdünnung in Kulturvertiefungen. Zweimal wiederholen bis 3 Kulturplatten mit doppelten serielle Verdünnungen für jeden Treffer Verbindung haben.
- Vorbereitung 37,5 ml einer HEK-293T-Zellsuspension bei 6 x 10 5 Zellen / ml in Kulturmedium, wie oben beschrieben (2.1 und 20,2). Dispense 2x 12,5 ml in Falcon-Röhrchen und infizieren Zellen entweder mit rMV2/Luc bei MOI = 0,1 oder rekombinanten CHIKV Renilla-Luciferase (CHIKV / Ren) Expression bei MOI = 0,2. Mischen durch Umdrehen.
Hinweis: CHIKV / Ren ist aus einem Wildtyp-Stamm von CHIKV abgeleitet und sollte daher in einem BSL3 Umgebung manipuliert werden. Die Platten können aus BSL3 zu BSL1 einmal bewegt Renilla Substrat zur Kultur Brunnen hinzugefügt werden (siehe unten). - Geben Sie 50 ul von nicht-infizierten, rMV2/Luc-infected oder CHIKV / Ren-infizierten Zellen in Kulturplatten mit seriellen Verdünnungen von Hit-Verbindungen. Inkubiere 24 Stunden bei 37 ° C.
- In 50 ul von Firefly Luziferase-Substrat zu Firefly Luziferase Aktivität in rMV2/Luc-infected Brunnen zu bestimmen. In 50 ul Renilla Luciferase Substrat Renilla Luciferase-Aktivität in CHIKV / Ren-infizierten Brunnen zu bestimmen. Schließlich, fügen Sie 50 ul Luciferase-Assay-Reagenz basiert Lebensfähigkeit zu nicht-infizierten Zellen zu Zelllebensfähigkeit zu bestimmen.
- Grundstücksdaten (Figure 4) und bestimmen getroffen Verbindung Konzentrationen, die MV-Replikation hemmen und CHIKV um 50%. Ignorieren Verbindung zeigt einige Toxizität in diesem Test.
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Representative Results
Dieses Screening-Pipeline setzt zunächst auf die Auswahl von Verbindungen, die MV-Replikation hemmen und keine signifikante zelluläre Toxizität (Abbildung 1, primären Bildschirm) nicht zeigen. Es nutzt Luciferase-basierte Assays zur Zelltoxizität und die Hemmung der viralen Replikation zu bestimmen. Alle Pipettierschritte und Datenerfassung in einem Hochdurchsatzeinstellung mit einer Roboter-Plattform ausgeführt werden.
Zytotoxizität von Verbindungen unter Verwendung eines Luciferase-Basis-Lebensfähigkeitstest, der die Anzahl der lebenden Zellen in der Kultur auf der Grundlage Quantifizierung der vorhandenen ATP, die metabolisch aktiven Zellen entspricht wertet bewertet. Da Luciferin Oxidation durch Luciferase ATP abhängig ist Lumineszenz-Signal direkt proportional zur zellulären ATP von lebenden Zellen zur Verfügung gestellt. 3A zeigt Ergebnisse für einen Vertreter Screening Platte. Wie erwartet, waren sehr unterschiedliche Messwerte Luciferase-Aktivitäted in den Kontrollvertiefungen, die entweder lebende Zellen oder toten Zellen mit IGEPAL getötet enthalten. Threshold ist empirisch μ + / 2 gesetzt, um herauszufiltern, Verbindungen zeigt einige zelluläre Toxizität und im vorliegenden Fall, 21 Verbindungen aus dieser Platte wurden verworfen. Parallel dazu wird die antivirale Aktivität über rMV2/Luc, einen rekombinanten Stamm von MV Luciferase exprimieren (Fig. 2) gemessen. Menschen HEK-293T-Zellen verwendet werden, weil sie sehr empfindlich auf MV-Infektion sind. Als Ergebnis ist die Luciferase-Aktivität in infizierten Kulturvertiefungen sehr hoch (200 bis 300 x 10 3 Einheiten Luciferaseaktivität in den Kontrollvertiefungen). Dies bietet einen großen dynamischen Bereich, der die Auswahl der MV-Replikationsinhibitoren erleichtert. 3B zeigt für ein Screening-Platte erhalten repräsentative Ergebnisse. Vier Verbindungen inhibiert die Virusreplikation um mehr als 75% in diesem Beispiel und wurden ausgewählt.
Schließlich Verbindungen, die nicht giftig sind und erzieltepositiv in dem viralen Replikationsassay ausgewählt (3A und 3B). Die Hälfte der maximalen Hemmkonzentration (IC50) sowohl auf MV und CHIKV, die zwei nicht verwandten RNA-Viren (Abbildung 1, sekundären Bildschirm) sind bestimmt. Die antivirale Aktivität von Hit-Verbindungen unter Verwendung von rekombinanten Virus-Stämme, die entweder Glühwürmchen (rMV2/Luc) oder Renilla (CHIKV / Ren) Luciferase bestimmt. 4A und 4B zeigen repräsentative Hemmkurven für MV und CHIKV Replikation sind. Diese Kurven werden verwendet, um zu bestimmen, IC50s der Trefferverbindungen. Parallel dazu wird das Fehlen von Zytotoxizität von ausgewählten Verbindungen in einer Dosis-Wirkungs-Experiment unter Verwendung des oben beschriebenen Luziferase-basierten Lebensfähigkeitstest (4C) bestätigt. Tabelle 1 zeigt IC 50-Werte für MV und CHIKV Replikation auf einem Satz von 13 nicht toxischen Verbindungen aus einer chemischen Bibliothek von 10.000 Molekülen identifiziert. Diese Komponentenunds sind sowohl hinsichtlich der chemischen Struktur und biologischen Aktivität Roman. Einige dieser Moleküle gemeinsamen strukturellen Ähnlichkeiten, und kann in drei verschiedenen chemischen Familien gesammelt werden. Als Referenz, mit Brequinar erhaltenen IC50-Werte in Tabelle 1 gezeigt. Brequinar ist ein Inhibitor der Dihydroorotatdehydrogenase, die vierte Enzym von Pyrimidin-Biosynthese, mit einem potenten antiviralen Aktivität in vitro 30,31. Beim Blick auf IC50-Werte, weniger als eine Größenordnung dieses Referenzmolekül getrennt von den meisten aktiven Hits von Screening identifiziert. Damit wurde die starke antivirale Aktivität von ausgewählten Verbindungen.
Abbildung 1. Zusammenfassung der Screening-Pipeline. Linke Seite zeigt die primary Bildschirm, wo Verbindungen werden für das Fehlen von Toxizität und die Fähigkeit, MV-Replikation blockieren ausgewählt. Rechte Tafel zeigt die sekundären Bildschirm, in dem die antivirale Aktivität von ausgewählten Verbindungen bestätigt wird, und ihre Fähigkeit, CHIKV Replikation blockieren bestimmt. Verbindungen, die effizient blockieren MV und CHIKV ohne nennenswerte Toxizität als potenzielle Breitspektrum-Inhibitoren der RNA-Viren betrachtet. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Abbildung 2. Genomische Organisation der rekombinanten RNA-Viren, die Luciferase-Gen. (A) rMV2/Luc: MV negativen Sense-RNA-Genom mit seinem 3'-Ende auf der linken Seite angezeigt wird, mit den sechs Genein Großbuchstaben angezeigt und als weiße Rechtecke dargestellt. Die zusätzliche Transkriptionseinheiten Codierung für das Reporter-Gen zwischen P-und M-Gene eingesetzt und als gelbes Rechteck dargestellt (B) CHIKV / Ren:. CHIKV die positive Sense-RNA-Genom ist mit seinem 5'-Ende verschlossen auf der linken Seite angezeigt wird, mit dem offenen Leserahmen, die vier nicht-strukturelle Proteine kodieren (nsP1-4). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse für eine 96-Well-Platte Screening. (A) mit dem Luciferase-Assay erhaltenen basierend Lebensfähigkeit Luciferase-Werte. Spalten 1 und 12 entsprechen alternative Kontrollen mit DMSO allein ("+", keine Toxizität) oder IGEPAL ("-", hohe Toxizität Stadt). Blaue Farbe hervorhebt, die Verbindungen nach der ATP-Konzentrationen im Kulturvertiefungen detektierten als nicht toxisch sind, während weiße Vertiefungen entsprechen toxischen Verbindungen (Luciferase-Werte <12.203 x 10 3). (B) mit rMV2/Luc-infected Zellen erhalten Luciferase-Werte. Spalten 1 und 12 entsprechen, um alternative Kontrollen, dh nicht-infizierten HEK-293T-Zellen ("-") oder rMV2/Luc-infected Zellen mit DMSO behandelt wurden ("+"). Für jede getestete Verbindung wird die Figur, welche sowohl die Luciferase Lumineszenzsignal und der Prozentsatz der Inhibition im Verhältnis zu den Vertiefungen zu steuern. Verbindungen Hemmung Lumineszenz-Signal um mehr als 75% sind gelb oder grün, je nachdem ob sie als giftig oder nicht, wie in (A) ermittelt wurden hervorgehoben. So ist grüne Farbe zeigt Hit Verbindungen, die MV-Replikation hemmen und wirken sich nicht auf die zelluläre Lebensfähigkeit.t = "_blank"> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 4. Dosis-Wirkungs-antivirale Wirkung und Toxizität von Verbindungen, C864, C648 und C062. (A) HEK-293T-Zellen wurden mit rMV2/Luc Stamm von MV infiziert Luciferase (MOI = 0,1) und mit steigenden Dosen von C864, C648, C062 oder DMSO inkubiert. Nach 24 Stunden wurde die Luciferase-Expression bestimmt. * Bedeutet, daß beobachtete Luciferase Hemmungen waren statistisch signifikant bei allen drei Verbindungen (p-Werte <0,05). (B) HEK-293T-Zellen wurden mit CHIKV / Ren-Stamm infiziert CHIKV Renilla Luciferase (MOI = 0,2) exprimiert, und mit zunehmender inkubiert Dosen von C864, C648, C062 oder DMSO allein. Nach 24 h wurde die Renilla Luciferase-Expression bestimmt. * Zeigt statistischtisch signifikante Hemmungen mit allen drei Verbindungen (p-Werte <0,05). (C) HEK-293T-Zellen wurden mit steigenden Dosen von C864, C648, C062 oder DMSO inkubiert. Als Kontrolle für Toxizität, wurden Zellkulturen mit 2,5 &mgr; l einer 0,5% IGEPAL Lösung ergänzt. Nach 24 Stunden wurde die Anzahl der lebenden Zellen unter Verwendung des Luciferase-basierte Lebensfähigkeitstest bestimmt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
| Chemische Familie | Verbindung | MV (IC50 uM) | CHIKV (IC50 uM) | CC50 (uM) |
| 1 | C864 | 0,6 | 0,6 | > 5 |
| 1 | C877 | 0,2 | 0,2 | > 5 |
| 1 | C957 | 1.2 | 1.2 | > 5 |
| 1 | C963 | 1.2 | 0,9 | > 5 |
| 1 | C967 | 1,7 | 1.6 | > 5 |
| 1 | C348 | 0,25 | 0,3 | > 5 |
| 1 | C265 | 0,25 | 0,3 | > 5 |
| 1 | C270 | 0,5 | 0,5 > 5 | |
| 1 | C350 | 0,4 | 0,5 | > 5 |
| 2 | C646 | 0,16 | 0,15 | > 5 |
| 2 | C814 | 1.9 | 1.1 | > 5 |
| 2 | C648 | 0,7 | 0,4 | > 5 |
| 3 | C062 | 1 | 1.2 | > 5 |
| Brequinar | 0,04 | 0,04 | > 5 |
Tabelle 1. Antivirale Aktivität und Zytotoxizität der 13Verbindungen ausgewählt aus der ursprünglichen chemischen Bibliothek. Die Ergebnisse sind als IC 50-Werte für die Hemmung der MV oder CHIKV Replikation exprimiert. CC50-Werte> 5 uM in Dosis-Wirkungs-Experimente aus dem sekundären Bildschirm gefunden für alle Verbindungen. Aber die Scoring-Filter Schwelle für Zytotoxizität von der primären Bildschirm legen nahe, dass CC50-Werte sind sogar> 20 uM.
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Discussion
Die hier beschriebene Screening-Pipeline zielt auf die Auswahl-Verbindungen mit einem geeigneten Profil als Breitspektrum-Inhibitoren der RNA-Viren. Wenn eine Bibliothek von 10.000 Verbindungen wurde mit diesem Protokoll und oben erwähnten Filterkriterien angewendet wurden untersucht, dh die Hemmung der MV-Replikation überlegen 75%, 40 Verbindungen (0,4%) als positiv. Dabei etwa die Hälfte von ihnen zeigten eine Toxizität in der Luciferase-Basis-Lebensfähigkeitstest, und wurden deshalb nicht berücksichtigt. Schließlich ein Dutzend Zugriffe leicht in größeren Menge wurden erneut getestet. Diese kleine Menge wurde leicht sowohl zelluläre Toxizität und der Inhibition der viralen Replikation und CHIKV gegen MV in der Dosis-Antwort-Experimente (Fig. 4) getestet. Die antivirale Aktivität von allen ausgewählten Verbindungen wurde bestätigt, und die gesamte Identifikationstrefferrate für dieses Screening-Pipeline 1,3 ‰. Diese Punktzahl ist sehr ähnlich wie die Resultate von anderen Gruppen mit verschiedenen Hochdurchsatz erhaltenReplikation basierten Screening-Assays für Virostatika 27,32 und fällt im erwarteten Bereich für zellbasierte Assays phänotypische im Allgemeinen (5.1 ‰ 33). Allerdings ist eine Trefferrate stark von sowohl der Verbindungsbibliothek, die gescreent wird, und die Bewertungsfilter Schwellenwerte, die je nach dem Profil der gesammelten Daten eingestellt werden können. Hier wurden ausgewählte Schwellenwerte für die Hemmung der MV-Replikation und Zelltoxizität empirisch ermittelt und Trade-off wurde eingestellt, um einen handhabbaren Anzahl der Treffer, die leicht in den sekundären Bildschirm gegen CHIKV erneut getestet werden können, zu erhalten.
In der primären Bildschirm wurden Verbindungen sowohl für ihre Fähigkeit, MV-Replikation und das Fehlen von Zelltoxizität blockieren getestet. Antivirale Aktivität wurde bei einer Konzentration von 2 &mgr; M auf rMV2/Luc-infected Zellen bestimmt wohinZellToxizität wurde bei 20 &mgr; M bestimmt. Diese experimentellen Einstellungen waren wertvoll, um direkt für die Verbindungen mit einem hohen Anti wählen gefundenvirale Aktivität im Vergleich zu Zelltoxizität. Darüber hinaus wurde der primäre Bildschirm in der Gegenwart von Uridin geführt. Tatsächlich deuten die jüngsten Veröffentlichungen, dass Verbindungen, die auf frühen Schritte der Pyrimidin-Biosynthese werden häufig isoliert bei der Suche nach Inhibitoren der RNA-Viren 13,16,27,28. Insbesondere haben Forschungsgruppen auf der Suche nach antiviralen Moleküle Inhibitoren der Dihydroorotatdehydrogenase, die vierte Enzym dieser Stoffwechselweg 31 gefunden. Uridin in Kulturmedium effizient trans-Komplemente zur Hemmung dieses Enzyms, und somit stellt die virale Replikation. Auf diese Weise werden Verbindungen, die MV-Replikation durch Hemmung der Pyrimidin-Biosynthese verhindern direkt von den antiviralen Treffern ausgeschlossen. Schließlich wurde die Z'-Faktor gefunden, systematisch über 0,5, was zeigt, das hohe Qualität und Robustheit des Assays.
Parallel wurde zelluläre Toxizität mit einem Hoch throughpu bestimmtt-Luciferase-Assay, der auf der Basis der Anzahl der metabolisch aktiven Zellen in Kultur, die auf die Quantifizierung des ATP bestimmt. In jedem Screening Platte wurde IGEPAL in den Kontrollvertiefungen für Toxizität aufgenommen. Dieses nicht-denaturierende, nicht-ionisches Detergens hat den Vorteil, effizient alle Zelltypen nicht spezifisch, ohne die Luciferase-Enzymaktivität zu töten. Z'-Faktor war, systematisch über 0,5 über 125 Platten und bewiesen damit die hohe Robustheit und Qualität des Assays. Eine Einschränkung dieses zelluläre Toxizität Test ist der relativ hohen Kosten. Als Alternative Assays zur Zelllebensfähigkeit zu bestimmen, haben einige Gruppen Zelllinien konstitutiv von einem stabilen 34-Transgen exprimieren Luciferase verwendet. In solchen Assays werden toxische Verbindungen erwartet zu verringern oder sogar zu unterdrücken, wenn die Luciferase-Expression beeinflussen zelluläre Lebensfähigkeit. Wir haben kürzlich eine stabile Zelllinie, auf IFN-β Stimulation 35 Luciferase exprimieren, und diese Zelllinie wurde verwendet, um eine tr testenaining Satz von 80 Verbindungen für die zelluläre Toxizität. Überraschenderweise wird der Korrelationskoeffizient (CC) zwischen diesem Assay und dem oben beschriebenen Luciferase-Basis-Lebensfähigkeitstest war relativ gering (CC = 0,67). In der Tat, mehrere Verbindungen beeinträchtigt Luciferase-Expression von Transgens, während ATP Stoffwechsel war unberührt. Einige Breitspektrum-antivirale Verbindungen sind wahrscheinlich zelluläre Funktionen wie die Zellsignalisierung Gentranskription und Proteintranslation, die auch zelluläre Genexpression beeinträchtigen beeinflussen. Zwar gibt es keine perfekte Screening-System für zelluläre Lebensfähigkeit, ist es in Gefahr, die Filterung toxischen Verbindungen auf Basis von zellulären Genexpression vorliegen, kann zu bona fide antivirale Moleküle auszuschließen.
Der sekundäre Bildschirm zielt darauf ab, die antivirale Aktivität von ausgewählten Verbindungen gegen zwei völlig unabhängige RNA-Viren, während die Bestimmung gerade ihre IC50s. Interessanterweise sollte bemerkt werden, dass das Enzym LuciferaseInhibitoren könnte fälschlicherweise als Positive in der rMV2/Luc Assay erzielt werden, aber solche Falsch-Positiven wird durch den sekundären Bildschirm herausgefilterten werden, wenn für die Hemmung der CHIKV / Ren getestet. Tatsächlich rMV2/Luc und CHIKV / Ren auszudrücken Glühwürmchen-und Renilla-Luciferase sind, und diese beiden Enzyme sind unabhängige und verschiedene chemische Reaktionen katalysieren. Verbindungen, die Glühwürmchen-Luciferase-Reporter aus rMV2/Luc in der primären Bildschirm hemmen, keine Aktivität gegen CHIKV / Ren zeigen und verworfen werden, wodurch ihre fehlerhafte Auswahl als antivirale Medikamente. Unerwartet Alle 13 Primär Treffern Sperrung MV-Replikation gehemmt CHIKV auch in diesem zweiten Bildschirm. Dies ist nicht immer der Fall, da einige MV-spezifische Inhibitoren isoliert wurden beim Screening anderen Bibliotheken (Daten nicht gezeigt). Weiterhin ausgewählten Verbindungen teilen strukturelle Ähnlichkeiten und kann in nur drei chemischen Familie (Tabelle 1) zusammengefasst werden. Verbindungen, die in einem chemischen Familie haben wahrscheinlich die gleiche Art der Aktiauf, und kann daher als Analoga des gleichen chemischen Einheit betrachtet werden. Dies relativiert die Tatsache, dass alle 13 ausgewählten Verbindungen hemmten sowohl MV und CHIKV Replikation. Dennoch könnten diese Ergebnisse auch darauf hin, dass Breitspektrum antiviralen Medikamenten sind häufiger als Virus-spezifische Inhibitoren identifiziert. Die rationale hinter dieser Hypothese ist, dass, trotz der offensichtlichen Spezifität, verlassen alle RNA-Viren auf den gleichen grundlegenden zellulären Funktionen zu replizieren, wie z. B. der ribosomalen Maschinerie, Zytoskeletts oder Mitochondrien als Energiequelle. Diese Funktionsmodule sind komplexen molekularen Systemen, die eine relativ große Gruppe von möglichen Zielen für Breitspektrum-antiviralen bereitzustellen. Im Gegensatz dazu gibt es nur eine begrenzte Anzahl von viralen oder zellulären Faktoren, die entsprechenden Ziele, um Virus-spezifische Inhibitoren erhöhen darstellen. In Zukunft sollen neue Platten von antiviralen Arzneimitteln durch phänotypische Screening identifizierten notwendigen Daten liefern, um zu bestätigen oder zu entkräften diese Hypothese.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Yves L. Janin für seine wertvollen Kommentare und Anregungen. Wir möchten HH Gad für CHIK / Ren und C. Combredet für ihre technische Unterstützung danken. Pasteur Mala infectieuses (Programm STING zu POV-und HM-- Diese Arbeit wurde vom Institut Pasteur, dem Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), dem Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM), dem Institut Carnot unterstützt L), der Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Programm STING 2.0 auf POV) und der "Conseil Régional d'Ile-de-France" (Chemical Library Project, Zuschüsse Nr. 06-222 I / R und I 09-1739 / R HM-L.). Die Arbeit an CHIKV / Ren wurde von den Projekt ArbOAS unterstützt (ANR Zuschuss-INTB 2010-1601-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-well polystyrene cell culture microplates, white | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity. |
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