في فيفو سيرنا ترنسفكأيشن والجينات ضربة قاضية في الحبل الشوكي عن طريق السريع موسع قطني داخل القراب الحقن في الفئران
Summary
ويصف هذا التقرير تقنية بسيطة وسريعة من داخل القراب ثقب إبرة لترنسفكأيشن المترجمة من سيرنا في النخاع الشوكي القطني في الماوس تحت التخدير قصيرة ضوء دائم.
Abstract
ويصف هذا التقرير دليل خطوة بخطوة لأسلوب الحقن داخل القراب إبرة حادة بطريقة موسع، أي مستقلة عن القسطرة زرع. الحد التقنية لهذه التقنية الجراحية تكمن في براعة من اليدين. حقن سريع، وخاصة بالنسبة للمجرب المدربين، ومنذ تعطل الأنسجة مع هذه التقنية هو الحد الأدنى، تكرار الحقن ممكنة؛ لا يحدث رد فعل وعلاوة على ذلك في مأمن من الأدوات الخارجية (مثل القسطرة.)، وبالتالي إعطاء محددة أفضل وأكثر من قراءة التشكيل الحبل الشوكي. منذ تطبيق هذه المادة يقتصر إلى حد كبير في المنطقة المستهدفة من الحبل الشوكي، والمخدرات، لا تحتاج إلى أن تطبق في جرعات كبيرة، والآثار غير المرغوب فيها الأهم على الأنسجة الأخرى، كما لوحظ مع التسليم النظامية، يمكن التحايل 1، 2. علاوة على ذلك، فإننا نقوم بدمج هذه التقنية في الجسم الحي مع ترنسفكأيشن من الحمض النووي بمساعدة polyethylenimالمعهد الوطني للإحصاء (PEI) كاشف 3، التي تنص على براعة هائلة لدراسة وظائف العمود الفقري عن طريق تسليم كلاء الدوائية وكذلك الجينات، والجيش الملكي النيبالي، وجهري البروتين.
Introduction
الحبل الشوكي هو مركز مهم جدا في مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية الأساسية والوظائف الفسيولوجية، بما في ذلك تجهيز ونقل مؤلمة (مسبب للألم) المدخلات 4-7. وقد تم تطوير تقنيات تجريبية مختلفة لتسهيل التشكيل الدوائية من الحبل الشوكي، مثل زرع المزمنة القسطرة داخل القراب 8، حقن مكروي الحبل الشوكي، وحقن إبرة داخل القراب 9. كل تقنية مزاياه وعيوبه، واعتمادا على نموذج التجربة أسلوب واحد قد يكون أكثر ملاءمة من غيرها. في حين زرع المزمنة القسطرة داخل القراب هو ممكن بسهولة في الفئران، وهذه الطريقة من الصعب جدا في الماوس، ونظرا حجم القيود. نسبة نجاح منخفضة جدا والعجز الحركي وغالبا ما تحدث بسبب وجود ضخمة من قسطرة في الفضاء تحت الجافية تقتصر بشدة في الماوس. وعلاوة على ذلك، يتم تقديم التسليم على المدى الطويل من الأدوية بسبب تخثر المتكررةمن مزروع مزمنة القسطرة. أخيرا، وردود الفعل المناعي شائعة.
يمكن التحايل هذه المشاكل باستخدام طريقة الحقن داخل القراب الحادة عن طريق إبرة في غياب قسطرة preimplanted، والتي تمكن التطبيق السريع وتشريحيا محدودة من الأدوية والكواشف إلى النخاع الشوكي لدى الفئران. هذا الأسلوب يحتفظ بالكامل فوائد التسليم داخل القراب على طرق أخرى النظامية التسليم (على سبيل المثال عن طريق الفم، في الوريد، داخل الصفاق، الخ) مثل خصوصية التشكيل الشوكي، والذي يسمح تخفيض الجرعات والآثار الجانبية الحد، وكذلك القدرة على تقديم المواد لا عادة لا عبور حاجز الدم في الدماغ منذ خلال حقن داخل القراب، يتم إدخال الإبرة بين الأم الجافية والحبل الشوكي. ولكن الأهم من ذلك، بالمقارنة مع غيرها من أساليب التسليم داخل القراب، وطريقة الحقن داخل القراب إبرة هو أقل الغازية، مما يتيح العديد من التطبيقات فينفس الحيوان دون أن تسبب أي تلف الأنسجة كبيرة أو إثارة رد فعل جهاز المناعة بسبب زرع المواد الأجنبية. ومع ذلك، فإنه يتطلب المهارات الفنية لاستهداف دقيقة جدا من الإبرة للسماح فعالية.
هنا، علينا أن نظهر بصريا طريقة لتحقيق المعدل الأمثل لنجاح تستهدف على وجه التحديد الحبل الشوكي القطني. موقع الحقن الذي يتم اختياره في هذه التجربة هو الأخدود بين L5 L6 وعمود فقاري، وبالقرب من حيث ينتهي الحبل الشوكي، للتقليل من إمكانية الإضرار العمود الفقري. علاوة على ذلك، ونحن لشرح استخدام هذه التقنية لنهدم الجينات في النخاع الشوكي باستخدام الرناوات siRNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
وبالتالي، فإن تقنية المبين أعلاه حقن إبرة داخل القراب هو فعال وسريع، مترجمة على وجه التحديد، وغير تدميري. من الناحية الفنية، فإن الجانب الأكثر أهمية من هذا الإجراء هو نقطة الإدراج الإبرة في الأخدود. فمن الأهمية بمكان أن يتم هذا الإجراء مع أيدي هادئة جدا والصبر. مثل ا?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| in vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulin III antibody | Sigma | T2200 | |
| Anti-WAVE1 antibody | R&D Systems | AF5514 | |
| Fast green dye | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isoflurane setup | Dräger Lübeck | ||
| Shaver | Wella | ||
| Hamilton syringe Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle | BD Microlance | 304000 | |
| Microscope Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 forward primer for qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 reversed primer for qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
Riferimenti
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling. Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).
- Goula, D., et al. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. , 1291-1295 (1998).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).
- Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2. Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).
- Song, Z. H., Takemori, A. E. Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).
- Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance. Neuroscienze. , 1275-1288 (2007).
- Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. , 677-681 (2006).
- Bourinet, E., et al. Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. EMBO J. 24, 315-324 (2005).
- Wang, X., et al. Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves. Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).
- Wigdor, S., Wilcox, G. L. Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).
