マウスにおける急速な非侵襲腰椎髄腔内注射を経由して生体内 siRNAトランスフェクションと脊髄における遺伝子ノックダウン
Summary
このレポートでは、短い持続軽麻酔下マウスにおける腰椎脊髄におけるsiRNAのローカライズされたトランスフェクションのための髄腔内針穿刺の簡便かつ迅速な技術が記載されている。
Abstract
このレポートでは、カテーテル注入のすなわち独立した非侵襲的な方法で、急性くも膜下針注射技術に関するステップバイステップガイドを、説明しています。この手術法の技術的な制限は、手のフィネスにある。注射は、特に訓練された実験のために、迅速であり、この技術では、組織破壊が最小であるので、反復注射が可能であり、外来ツールにさらに免疫反応が起こらず、それによってより良く読み出すより具体的に与えること（ 例えばカテーテル）。脊髄変調の。物質の適用は、主として脊髄の標的領域に制限されるので、薬物は、大用量で適用する必要はなく、他の組織でのより重要なのは望ましくない効果は、全身送達で観察されるように、1を回避することができる2。また、我々はpolyethylenimの助けを借りて、核酸のin vivoトランスフェクションで、この手法を組み合わせるINE（PEI）の薬理学的薬剤の配信だけでなく、遺伝子、RNA、およびタンパク質モジュレーターを経由して 、脊椎の機能を研究するための多大な汎用性を提供し、試薬3、。
Introduction
脊髄は加工や痛みを伴う（侵害受容性）の入力4-7の送信を含む主要な生物学的プロセスおよび生理的機能の様々な非常に重要な中心地です。様々な実験技術は、髄腔内カテーテル8、脊髄マイクロインジェクション、および髄腔内注射針9の慢性的注入として、脊髄の薬理学的調節を容易にするために開発されてきた。それぞれの手法には独自の利点と欠点があり、実験パラダイムによっては一つの技術は、他よりも適しているかもしれません。髄内へのカテーテルの慢性的注入はラットにおいて容易に実現可能であるのに対して、この方法は、サイズの制限が指定され、マウスでは非常に困難である。成功率は非常に低く、運動障害は、しばしば、マウスにおいて厳しく限定さ硬膜下腔カテーテルのかさばる存在に起こる。また、薬の長期的な配信が頻繁な血液凝固にレンダリングされる慢性的に注入されたカテーテルの。最後に、免疫反応が一般的です。
これらの問題は、マウスの脊髄への薬物および試薬の迅速かつ解剖学的に制限されたアプリケーションを可能にしますpreimplantedカテーテルの非存在下で針を介して急性髄腔内注射の方法を使用して回避することができる。この方法は、完全に脊椎低減投与量および制限副作用を可能にする調節、ならびに物質がない送達する能力の特異性のような他の全身送達経路（ 例えば 、経口、静脈内、腹腔内等 ）上の髄腔内送達の利点を保持する髄腔内注射の間、針が硬膜と脊髄の間に挿入されているため、通常は血液脳関門を通過しない。しかしながら重要なことには、髄腔内送達の他の方法と比較して、髄腔内注射針注入法では、多数のアプリケーションを可能にする、最小侵襲性で任意のかなりの組織損傷を引き起こしたり、異物の移植による免疫反応を惹起せずに同じ動物。ただし、有効性を可能にするために、針の非常に正確な標的化のための技術的なスキルが必要です。
ここでは、視覚的に具体的に腰部脊髄を標的化するための最適な成功率を達成するための方法を示す。この実験で選択される注射部位は、脊髄脊椎を損傷する可能性を最小限にするために、終了に近いところ、L5およびL6脊椎動物列間の溝である。また、我々は、siRNAを用いた脊髄中の遺伝子をノックダウンするために、この技術の使用を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
従って、髄腔内注射針の上記の技術は、有効な高速、特異的に局在し、かつ非破壊的である。技術的には、この手順の最も重要な側面は、溝に針の挿入のポイントです。それは、この手順は非常に穏やかに手と忍耐で行われていることが重要です。多くの外科的処置と同様に、トレーニングが成功した注入速度を向上させます。実際の実験中に、この手法は、直接注射が成功したか否かを確?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| in vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulin III antibody | Sigma | T2200 | |
| Anti-WAVE1 antibody | R&D Systems | AF5514 | |
| Fast green dye | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isoflurane setup | Dräger Lübeck | ||
| Shaver | Wella | ||
| Hamilton syringe Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle | BD Microlance | 304000 | |
| Microscope Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 forward primer for qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 reversed primer for qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
Riferimenti
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