여기서, 우리는 인간의 생물학적 기능을 다시 요약 관대 배양 조건 하에서 수축성 근섬유 (myospheres)의 입체 클러스터를 형성하는 골격 근육 원종의 균질 한 집단을 생성 향해 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)의 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 기반 프로토콜을 설명 골격 근육.
인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 골격 근육 세포의 균일하고 풍부한 인구의 생성은 세포 기반 치료를위한 인간 신경 근육 질환의 모델 "접시에있는 질병"에 대한 요구 사항입니다. 이러한 낮은 풍부하고 또한 인구뿐만 아니라, 입체적인 수축성 구조체의 형성을위한 프로토콜의 부족의 불균일 등 주요 장애물은, 신경 근육 질환에 대한 줄기 세포의 응용을 제한했다. 우리는 인간 배아 줄기 세포에 정의 된 요소의 자궁외 도입하여 이러한 한계를 극복하는 프로토콜을 디자인 한 – 근육의 결정 인자 MyoD 및 SWI / SNF 염색질 복잡한 구성 요소 BAF60C 리모델링 – 골격 근육 세포로 인간 배아 줄기 세포를 재 프로그램 할 수있다. 여기서 우리는 프로토콜의 hESC 파생 된 근원 세포를 생성하고 삼차원 적 소형화 구조 (myospheres)에 자신의 클러스터링을 촉진하기 위해 설립 설명하는 기능적 모방 소형 골격 근육 7 </sup>.
능성을 유지하면서 때문에 그들의 독특한 능력의 자기 갱신, 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 재생 의학의 귀중한 자원으로 간주됩니다. 체외 질병 모델링을위한 골격 근육의 병에 걸린 근육과 hESC의 또는 유도 만능 줄기 세포의 세포 매개 다시 채우기 줄기 (IPSC)에서 파생 된 세대는 치료를 식별하고 많은 신경 근육 질환의 발병 기전을 해명하기위한 연구의 주요 목표입니다. 그러나 이러한 연구는 골격근 세포로 변환하는 인간 배아 줄기 세포의 저항과 골격 근육 생성을 향해 hESC의 – 약속의 분자 규제에 관한 정보의 소수에 의해 도전을 받고있다. 사실, 인간 배아 줄기 세포에서 골격 근육 전구 세포를 생성하는 이전의 시도는 배아 바디 (EB)에서 유래 된 자손 또는 중간 엽 세포는 전사 활성제의 자궁외 식 (다음 골격 근육 생성을 활성화 할 능력이 있다는 것을 밝혀 예PAX3 또는 Myf5) 1-3 또는 특정 배양 조건 4-5에 노출.
우리는 이전에 (SMARCD3에 의해 암호화) SWI / SNF 구성 요소, BAF60C는, 근육의 특정 유전자좌 6 MyoD 매개 활성화를 허용하는 전사 기계의 필수 구성 요소입니다 것으로 나타났습니다. 우리는 최근에 BAF60C의 선택 부재는 인간 배아 줄기 세포에, 그렇지 않으면 체세포 8-10을 표현 BAF60C에서 관찰 골격 근육 생성 7 MyoD 매개 활성화에 대한 저항성을 부여하는 것을 발견했다, 과정은 일반적으로 근육 조직 전환 함. BAF60C의 강제 식 직접 BAF60C 및 근육 조직 계보 7으로 인간 배아 줄기 세포를 저지른 성적인 서명을 부과 MyoD으로, 특정 배양 조건에 따라, 인간 배아 줄기 세포에서 골격 근육 생성을 활성화 MyoD 수 있습니다. 참고로, 이전의 단백체 분석 BAF6의 선택이 없음을 밝혀0C는 SWI / SNF의 구성 요소 중, 줄이고 ESCs 11. 우리는 3 차원 수축을 형성하기 위해 통합 할 수있는 골격 근육 아세포의 균질 인구의 세대로 이어지는, 근육 조직 계보에 인간 배아 줄기 세포의 후 성적인 노력을 부과하는이 기술을 사용 구조 (myospheres) 그 기능을 모방 소형 골격 근육 7. 사실, 인간 배아 줄기 세포에서 골격 근육 전구 세포를 생성하는 우리의 방법은 휴대 등의 세포 분화 신호에 노출 될 때까지 표현형 잠재적 인 근육 조직 혈통에 인간 배아 줄기 세포의 후 성적인 노력에 의존 차별화 매체의 집계와 문화 (특정 프로토콜 참조). 이 전략은 성적으로 골격 근육 계통에 최선을 다하고 조직 학적과 골격의 기능적 특성을 요점을 되풀이 입체 수축 myospheres의 형성에 적합한 인간 배아 줄기 세포의 균일 한 인구의 확장을 허용근육. myospheres 근육 질환의 모델 "접시에있는 질병"에 대한 악용 소형화 근육의 첫 번째 증거를 제공합니다. 환자 유래 유도 만능에서 발생하는 경우,이 myospheres은 치료 화합물의 높은 처리량 검사를위한 도구로 엄청난 잠재력을 제공 할뿐 아니라, 오랜 개발 질문을 명료하게 할 수있는 잠재력 및 희귀 질환의 발병 기전이있다. 우리는 또한 고메스 등. (12)에 의해 조브 프로토콜에 설명 된대로 myosphere 분석 한 즉시 판독이 부분에 대한 면역 조직 화학 염색에 의해 제공 될 수 있습니다
여기에서 제안 된 프로토콜은 직접 인간 배아 줄기 세포에서 수축 근섬유 (myospheres)의 3 차원 클러스터를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 제안 된 전략은 심사 분석 및 개발 연구 모두를위한 모델 "접시에있는 질병"으로 적합 할 수있다 서스펜션 미니 근육을 생성하는 전례가없는 뛰어난 잠재력을 가지고 있습니다. 게다가 인간 배아 줄기 세포로부터 myospheres를 생성하는 방법은 간단하고 일반적으로 복구 세포의 수율에 부정적인 영향을 감별 도중 어떤 FACS 소팅 공정을 필요로하지 않는다. 이 단일 세포로 EB의 해리를 의미 이후 게다가, 분화 동안에 정렬 절차는 응집을 방해한다.
제안 된 방법은 다 능성 배아 줄기 세포에서 발현되지 않는 특정 요인, MyoD 및 BaAF60C와 인간 배아 줄기 세포의 후 성적인 reprograming을 기반으로합니다. MyoD 및 BAF60C는 "핵심"단백질 복잡한 일에게 제공자국에서 전사가 골격 근육 조직 프로그램을 활성화하기 위해 진행되는 게놈 유전자 좌. 두 요소는 렌티 바이러스 감염에 의해 세포에 전달하고 모든 세포에서 두 요인의 감염의 고효율을 얻을 수 있으므로 중요된다. 이것은 높은 역가의 바이러스 또는 선택 마커 부여 바이러스를 사용하여 달성 될 수있다. 배양 조건은 근육 조직의 분화의 정도를 최적화하는 중요한 역할을한다. 골격 myotubes에 근육 조직 전구체의 변환을 달성하기 위해 – 우리는 혈청 정의 된 배지에서 배양 (ITS 인슐린 트랜스페린을 포함) 다음에, 근원 전구체의 클러스터로 인간 배아 줄기 세포를 표현 MyoD/BAF60C의 분화에 대한 혈청 기반의 차별화 프로토콜을 제안한다. 그러나, 정의 된 다른 매체와 동일하거나 더 나은 근원 성 분화를 달성 할 수있는 것이 가능하다. 프로토콜의 하나의 전류 제한은, 게다가 함유 태아 혈청의 사용에 의존한다는 것이다많은 동물성 단백질과 물질을 보내고, 로트의 변화를 보여줍니다. 이 myospheres 내 근육 조직 전환의 낮은 효율성 또는 이질의 원인이 될 수 있습니다. 참고로, BAF60/MyoD-expressing 인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 모든 EB 같은 구조는 myospheres 것은 아닙니다; 즉, 일부는 완전히 근섬유로 구성 EB 같은 집계입니다. (결과 참조) 프로토콜의 끝에서 수행 EB 섹션에 의해 추정 된 면역 염색으로 정상적으로 BAF60C 및 MyoD 발현을 인간 배아 줄기 세포 유래의 myospheres 수가 30-60% 변할 수있다. 만 myospheres의 배양 접시를 풍부하게하는 잠재적 인 방법은 근육 조직 기자를 사용하는 것입니다. 이는 부분적으로 또는 분화하지 EB 같은 클러스터를 폐기하고 오직 myospheres를 선택하는 것이 용이.
마지막으로, 도입 된 요소의 시간적 요건을 기본 메커니즘을 더 잘 이해가 전달 방법을 개선하는 것이 유용 할 것이다. 예를 들어, BAF60C 및 MyoD는 SH 필요오트 시간은 올바른 방향 "킥"세포에, 수정 된 mRNA의 납품에 근거를 둔 방법을 적용 할 수 있습니다. 인자가 세포가 내인성 단백질을 이용하기 전에 장시간이 필요한 경우에 대조적으로, 에피 솜 접근법은 가변성 및 게놈 통합 때문에 제어되지 않은 효과를 제거하기 위해 추천된다. 마지막으로, 우리는 이전 골격근에 hESC의 전환을 달성하기 위해에 또는 MyoD (결코 이후)과 동시에 BAF60C을 표현하는 필수되어 있습니다. BAF60C의 사전 식에 대한 요구 사항은 아마도 게놈 6,15 통해 적절한 MyoD 염색질 배포를위한 성적인 풍경을 미리 설정하는 역할에 의존합니다. 따라서, 미래의 프로토콜은 화합물 또는 인간 배아 줄기 세포에서 BAF60C 발현을 촉진 다른 조작에 의해 개선 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
PLP는 샌포드 어린이 건강 연구 센터의 부교수 탐정이다. R01AR056712, R01AR052779 및 관절염 및 근골격계의 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소 및 피부 질환 (NIAMS), MDA와 샌포드 어린이 건강 연구 포상에서 P30의 AR061303 :이 작품은 PLP에 다음 교부금에 의해 지원되었다. 이 작품은 부분적으로 프로젝트에서 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램에서 연구 자금 조달에서 도움이되고 FP7 – 건강 – 2009 년 ENDOSTEM 241440 (수리 및 근육 조직의 유지를 위해 혈관 관련 줄기 세포와 근육 줄기 세포의 활성화) SA에 의해 지원되었다. CIRM의 교제.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |