在这里,我们描述了基于人类胚胎干细胞(胚胎干细胞)的产生向着那宽容的培养条件下形成的收缩肌纤维(myospheres)三维簇骨骼肌祖细胞,它概括人类的生物学特性均匀人口表观遗传重编程的协议骨骼肌。
从人胚胎干细胞(胚胎干细胞)的骨骼肌细胞的均匀和丰富人口的产生是基于细胞的疗法和一个“病在培养皿中的”人神经肌肉疾病的模型的要求。主要的障碍,如低丰度和兴趣的人群,以及缺乏对三维收缩结构的形成协议的异质性,限制了干细胞的应用神经肌肉疾病。我们设计了一个协议,它通过引入异位定义因素克服了这些限制在人类胚胎干细胞 – 肌判定因素的MyoD和SWI / SNF染色质重塑复合成分BAF60C – 那些能够胚胎干细胞重新编程为骨骼肌细胞。在这里,我们描述了协议的成立,以产生人类胚胎干细胞来源的成肌细胞,促进其聚集成三维微型结构(myospheres)在功能上模仿小型化骨骼肌7 </sup>。
由于其独特的能力,自我更新,同时保持多能性人类胚胎干细胞(胚胎干细胞)被认为在再生医学的宝贵资源。茎病变肌肉和人类胚胎干细胞或诱导多能干细胞的细胞介导的再增殖(IPSC)衍生代骨骼肌体外疾病模型是研究目的是确定治疗方法和阐明许多神经肌肉疾病的发病机制主要目标。然而,这些研究已经由人类胚胎干细胞,以转化成骨骼肌细胞的电阻和通过的关于向骨骼肌成肌的hESC承诺的分子调控信息的缺乏的挑战。事实上,以前曾试图从人类胚胎干细胞生成骨骼肌祖细胞显示,只有胚体(EB)衍生的后代或间质细胞有能力来激活骨骼肌成肌下面的转录激活因子的异常表达( 如PAX3或MYF5)1-3或暴露于特定的培养条件4-5。
之前我们已经表明,SWI / SNF成分,BAF60C(由SMARCD3编码),是转录机制,使肌肉特异性基因座6 MyoD调控活化的重要组成部分。我们最近发现,选择性缺席BAF60C的赋予到胚胎干细胞向骨骼肌成肌7是在BAF60C另有观察到表达的体细胞8-10中MyoD调控活化的阻力,这个过程通常被称为生肌转换。 BAF60C的强制表达MyoD的能够直接激活骨骼肌肉发育中的胚胎干细胞,在特定的培养条件下,与BAF60C和MyoD的强加一个后生签字,承诺对人类胚胎干细胞的肌源性谱系7。值得注意的是,以前的蛋白质组学分析揭示了选择性缺席BAF6的0℃时,SWI / SNF组件中,在胚胎干细胞11。我们用这些知识来强加人类胚胎干细胞的表观遗传承诺到生肌血统,导致可能被整合,形成立体的收缩骨骼肌成肌细胞的同质群体的产生结构(myospheres)在功能上模仿小型化骨骼肌7。事实上,我们从人类胚胎干细胞产生骨骼肌祖细胞的方法依赖于人类胚胎干细胞的肌源性谱系,这是表型潜直至细胞暴露于分化的信号,如细 胞的表观遗传学承诺聚集和培养在分化培养基(具体见协议)。该策略允许人类胚胎干细胞的同质人口膨胀所表观遗传学致力于骨骼肌谱系,并适用于形成了重述组织和骨骼肌功能特性的三维收缩myospheres肌肉。该myospheres提供小型化的肌肉可开发为一种“病在培养皿中”肌肉疾病模型的第一个证据。当从来自患者的iPS细胞产生的,这些myospheres所澄清的长期发展问题的潜力和罕见疾病的发病机制,此外还提供了巨大的潜力作为治疗化合物的高通量筛选的工具。我们还注意到,myosphere分析的一个直接读出可以通过免疫组化可提供的部分,在由戈麦斯等人 12朱庇特的协议描述
这里提出的协议描述了如何直接从人类胚胎干细胞产生收缩肌纤维(myospheres)的三维集群。提出的策略具有前所未有的非凡潜力以生产微型肌肉悬吊,可适合作为“病在一盘”的模式为筛选试验和发育研究。此外,为了从胚胎干细胞产生myospheres该方法是简单的,并且不需要在分化过程中的任何FACS分选工序中,其典型地具有在细胞中回收的产率产生不利影响。此外,分化过程中的分拣过程会干扰聚合,因为它意味着在EB解离成单细胞。
所提出的方法是基于人类胚胎干细胞的表观遗传学reprograming与特定的因素,MyoD的和BaAF60C,它们不表达多能性胚胎干细胞。 MyoD的和BAF60C提供的“核心”蛋白复合物第在标记的基因组位点从该转录进入激活骨骼肌肌原程序。这两个因素的慢病毒感染的手段被传递到细胞中,因此,关键是要获得具有高感染效率这两个因素中的所有单元格。这可以通过使用高滴度的病毒或病毒赋予了选择标记物来实现。培养条件在优化肌分化的程度也起着重要的作用。我们提出了一种基于血清的分化方案为MyoD/BAF60C的表达胚胎干细胞成簇生肌前体的分化,其次是(含有胰岛素转铁蛋白 – ITS)孵育在无血清的确定成分培养基,以实现转换生肌前体的成骨骼肌肌管。然而,它可能是其他定义的媒体可以实现相同或更好的肌分化。该协议的一个电流限制是,它依赖于使用的胎牛血清,其中,除了含有ING许多动物蛋白和物质,显示很多到很多的变化。这可能会导致myospheres内低效率或异质生肌转换。值得注意的是,并非所有的BAF60/MyoD-expressing胚胎干细胞衍生的EB-样结构是myospheres;即,有些是EB状集合体完全由肌纤维。 myospheres通常在胚胎干细胞表达BAF60C和MyoD的派生数可以从30到60%的估计,在免疫染色在协议结束时进行的EB段(见结果)而有所不同。丰富培养皿仅供myospheres一个潜在的方法是使用一个生肌记者。这将有利于丢弃部分或完全没有区别的EB-成簇状并仅选择了myospheres。
最后,更好地了解相关的介绍的因素时间要求的机制是提高交付的方法是有用的。例如,如果BAF60C和MyoD的需要只为sh的以“踢”的细胞在正确的方向,基于改进的基因传递方法可能适用ORT时间。相反,如果需要一个较长的时间之前将细胞利用其内源性蛋白的因素,附加型的方法将被推荐给消除变异和由于整合在基因组中不加控制的效果。最后,我们注意到,它是强制性的,以表达BAF60C,以达到人类胚胎干细胞转化为骨骼肌之前或在同一时间MyoD的(从未之后)。对于BAF60C前表达的要求想必依靠其作用,通过基因组6,15预先设定的后生景观进行适当的MyoD染色质分布。因此,未来的协议可能由化合物或促进人类胚胎干细胞BAF60C表达其他操作得到改善。
The authors have nothing to disclose.
PLP是桑福德儿童健康研究中心的助理研究员。 R01AR056712,R01AR052779并从关节炎,肌肉骨骼的健康/国立研究所和皮肤病(NIAMS),MDA和桑福德儿童健康研究奖P30 AR061303:该作品已被以下补助工党的支持。这项工作在一定程度得益于科研经费从该项目中的欧盟第七框架计划FP7 -健康- 2009 ENDOSTEM 241440( 血管相关的干细胞和肌肉干细胞的修复和维护肌肉组织中的激活)股份有限公司是由支持。 CIRM奖学金。
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |