脂質ナノチューブ上血液凝固第VIII因子の螺旋組織
Summary
ヒトおよびブタ：我々は、2つの高度に相同なFVIII形態の膜結合構造を解決するために適用クライオ電子顕微鏡法、脂質ナノテクノロジー、および構造解析の組み合わせを提示する。螺旋状に負に荷電した脂質ナノチューブ（LNT）上の二つの機能の組換えFVIIIフォームを整理するために私たちの研究室で開発された方法論が記載されている。
Abstract
低温電子顕微鏡法（低温電子顕微鏡）1は、水和状態と膜環境2内のタンパク質との複合体の機能的な構造を調査するための強力なアプローチである。
凝固因子VIII（FVIII）3は、マルチドメイン血漿糖タンパク質である。重度の出血性疾患 – FVIIIの欠損または欠乏が血友病A型の原因である。タンパク質分解活性化されると、FVIIIは正常な血液凝固4のために重要である、負に帯電した血小板膜上のセリンプロテアーゼIXa因子に結合する。 FVIII凝固で果たす重要な役割にもかかわらず、その膜結合状態の構造情報は、5不完全です。組換えFVIII濃縮物は、血友病A型に対する最も有効な薬物であり、市販のFVIIIは、ヒト又はブタ、ヒト第IXa因子6,7の両方の機能的複合体を形成するように表すことができる。
">本研究では、低温電子顕微鏡法（低温電子顕微鏡）の組み合わせを提示し、脂質ナノテクノロジー、構造解析は、2つの高度に相同的FVIII形の膜結合構造を解決するために適用される：ヒトとブタの研究室で開発された方法論螺旋状に負に荷電した脂質ナノチューブ（LNT）に二つの機能の組換えFVIIIフォームを整理することは記載されている。代表的な結果は、我々のアプローチは、シーケンス内の高度に相同性2（86％の配列同一性との間に螺旋状の組織の違いを定義するのに十分に敏感であることを証明している）タンパク質ヘリカル組織、低温電子顕微鏡と電子断層撮影（ET）データ取得のための詳細なプロトコールは、二次元（2D）所与の三次元（3D）構造解析は、ヒトおよびブタの3次元再構成を得るために適用されるFVIII-LNTが議論されている。提示、ヒトとブタFVIII-LNT構造はcalculatするために提案手法の可能性を示す高解像度での血液凝固因子VIIIのe機能、膜結合組織。Introduction
血液凝固第VIII因子（FVIII）は、6つの領域で編成2,332アミノ酸の大きな糖タンパク質である：A1-A2-B-A3-C1-C2 3。トロンビンの活性化FVIIIは膜結合テナーゼ複合体中の第IXa因子の補因子として機能したら。膜に依存した方法でのFIXaに活性化FVIII（FVIIIaの）の結合は、効率的な血液凝固4のために重要である、FIXaのタンパク質分解効率を10以上の5倍を強化します。 FVIIIは、凝固およびテナーゼ複合体形成に果たす重要な役割にもかかわらず、機能的な膜結合FVIII構造が解決されていている。
これに対処するために、高親和8,9とFVIIIと結合し、活性化血小板表面に似ていることが可能なホスファチジルセリン（PS）に富む単一脂質二重層ナノチューブ（LNT）は、10が開発されている。 LNTにバインドされたFVIIIの連続した螺旋状の組織がeffectiであることが証明されました低温電子顕微鏡5によるFVIII膜結合状態の構造決定のためのVEの。官能化されたLNTは低温電子顕微鏡11、12によって螺旋状に編成膜関連タンパク質のタンパク質-タンパク質及びタンパク質-膜の相互作用を研究するために理想的なシステムです。試料を添加し、同位体なしで生理的環境（バッファ、膜、pH）で、最も近いで保存されているように低温電子顕微鏡は、X線結晶解析やNMRなどの伝統的な構造的な方法に比べて利点があります。 LNTは、サイズ、形状および組成テナーゼ複合体がインビボでアセンブル活性化血小板の偽足により密接に似ているように、FVIIIの場合、この手法で膜結合構造を研究することは、さらにより生理学的に関連する。
欠陥およびFVIIIの原因血友病A、人口4、6の1 5000の男性に影響を与える重大な出血性疾患の欠乏。ほとんどの電子血友病Aのffective療法は、組換えヒトFVIII（hFVIII）の生涯にわたる投与である。組換え第VIII因子血友病A治療の重要な合併症は、血友病A患者13の約30％に影響を与える人間の形に阻害抗体の開発である。ブタFVIIIがヒトFIXaを7ヒトFVIIIおよびフォームの機能的複合体に対する阻害抗体との低い交差反応性を表示するように、この場合には、ブタFVIII（pFVIII）濃縮物を、使用される。ブタおよびヒトFVIIIの両形態の膜結合組織を確立することは、FVIII補因子機能と血液止血のための含意の構造的基礎を理解することが重要です。
本研究では、脂質ナノテクノロジー、クライオEM、及び2つの高度に相同なFVIII形態の膜結合組織を解決するために設計された構造解析の組み合わせを記載している。螺旋状に組織化さporciに提示低温電子顕微鏡データと3次元構造負に帯電したLNT上のNEとヒトFVIIIはFVIIIおよび生理的膜環境における膜結合型凝固因子との複合体の構造決定のための基礎として提案されたナノテクノロジーの可能性を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
人間とブタFVIIIの自己組織化、人体に遭遇する条件で脂質ナノチューブ上：この作品では方法論は、高度に相同タンパク質の2膜結合組織を区別するために提示されている。
記載されている手順では、ヒトとブタFVIIIが正常に最も重要なステップである、脂質ナノチューブに螺旋状に整理されています。次の重要なステップは、近い液体N 2温度…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
10SDG3500034とUTMB-NCB SSMに資金を起動します。この作品は、米国心臓協会から全国科学者開発助成金によってサポートされています。著者は、シーリーUTMBでの構造生物学研究センター（AT低温電子顕微鏡および科学計算施設を認めるwww.scsb.utmb.edu ）だけでなく、博士。 2次元と3次元の螺旋再構成アルゴリズムのヘルプのためのスティーブLudtkeとエドEgelman。
Materials
| JEM2100 with LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | operated at 200 kV |
| with TEMCON software | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 Cryo-holder | Gatan, Inc. | 626.DH | cooled to -175 °C |
| with temperature controler unit | Gatan, Inc. | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Inc. | US4000 | 4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution |
| Solarus Model 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| Materials | |||
| Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid | Ted Pella | 01821 | plasma cleaned for 10 s on high power |
| Quantifoil R2/2 300 mesh | Electron Microscopy Sciences | Q225-CR2 | Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes |
| Uranyl acetate dihydrate | Ted Pella | 19481 | 1% solution, filtered |
| Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
| Software | |||
| EM software Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM software EMAN | free download | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ | |
| EM software Spider | free download | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| EM software IHRSR | free download | Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
| EM software (IMOD) | free download | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| EM software (SerialEM) | free download | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
| UCSF-Chimera | free download | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |
Riferimenti
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