Aantonen van een multiresistente<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Versterking Microarray
Summary
Een amplificatie microarray combineert asymmetrische PCR-amplificatie en microarray hybridisatie in een enkele kamer, die aanzienlijk stroomlijnt microarray workflow voor de eindgebruiker. Vereenvoudiging microarray workflow is een noodzakelijke eerste stap voor het maken van microarray-gebaseerde diagnostiek die routinematig kan worden gebruikt in een lagere-resource-omgevingen.
Abstract
Vereenvoudiging microarray workflow is een noodzakelijke eerste stap voor het creëren van MDR-TB-microarray gebaseerde diagnostiek die routinematig kan worden gebruikt in een lagere-resource-omgevingen. Een amplificatie microarray combineert asymmetrische PCR-amplificatie, doelgrootte selectie, doel etikettering, en microarray hybridisatie binnen een enkele oplossing en in een enkele microfluïdische kamer. Een batch processing methode wordt gedemonstreerd met een 9-plex asymmetrische master mix en low-density gel element microarray voor genotypering van multiresistente Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). De hier beschreven protocol kan in 6 uur worden ingevuld en voorzien juiste genotypering met minstens 1.000 cel equivalenten van genomisch DNA. Integratie on-chip wasstappen haalbaar, wat zal resulteren in een volledig gesloten amplicon werkwijze en systeem. De omvang van multiplexing met een amplificatie microarray uiteindelijk beperkt door het aantal primerparen die kunnen worden gecombineerd tot een enkele master mix en toch bereiken gewenste gevoeligheid en specificiteit prestatiemetingen dan het aantal probes die zijn geïmmobiliseerd op de array. Evenzo kan de totale analysetijd verkort of verlengd worden afhankelijk van de specifieke beoogde toepassing, vraagstelling en gewenste detectiegrenzen. Toch is de algemene aanpak aanzienlijk stroomlijnt microarray workflow voor de eindgebruiker door het verminderen van het aantal arbeidsintensieve en tijdrovende processtappen, en biedt een vereenvoudigde biochemische en microfluïdische pad voor het vertalen van microarray-gebaseerde diagnostiek in de dagelijkse klinische praktijk.
Introduction
Vroege opsporing en snelle behandeling worden beschouwd als de meest effectieve controle strategieën om Mycobacterium tuberculosis (MTB) transmissie 1 verminderen, en er is nu een brede consensus in de tbc-gemeenschap die een point of care (POC) of in de buurt POC test om gelijktijdig diagnosticeren TB en resistentie tegen (DR) nodig. Technologieën zoals Cepheid GeneXpert en andere nucleïnezuur amplificatie testen verminderen de tijd tot de diagnose voor veel tbc-patiënten, en zorgen voor een snelle uitlezing aangeeft resistentie tegen rifampicine of geselecteerde mutaties die resistentie tegen andere eerste of tweede lijn drugs 2. Hoewel realtime isotherme nucleïnezuur amplificatie zijn bedoeld om de resistentie mutaties die leiden tot MDR-TB identificeren, het spectrum van mutaties detecteren ze vaak ontoereikend om een geïndividualiseerd drugregime overeenkomt met de resistentie profiel van de patiënt te ontwerpen, en technische beperkingen met betrekkingoptische overspraak of de complexiteit van amplificatie en rapportage chemische 03-07 mei het aantal loci of mutaties die worden gedetecteerd beperken. Zo detectie technologieën met een hogere multiplexing capaciteit nodig zijn om bekend hiaten in MDR-TB POC diagnostiek.
Microarrays en de WHO-onderschreven Hain lijnprobe testen kunnen de "meerdere genen, meerdere mutaties" uitdaging van de diagnose van MDR-TB 8-29 pakken. Helaas zijn deze hybridisatie gebaseerde, multiplex detectie platforms gebruiken multistep, ingewikkeld, en open-amplicon protocollen die significante opleiding en deskundigheid in de moleculaire technieken vereisen. De amplificatie microarray 30 is ontworpen om een aantal van deze microarray workflow en operationele problemen aan te pakken. De vereenvoudiging van vloeibare principes zijn aan te vullen, hybridiseren, en detecteren nucleïnezuur doelen binnen een enkele microfluïdische kamer. De gebruiker nucleïnezuur en amplificatie introduceert master mengen in een vloeibare kamer met een pipet en begint de thermische cycli protocol. Voor de batchverwerking methode hier getoond, zijn microarrays vervolgens gewassen in bulk oplossing, gedroogd, en afgebeeld. Deze studie toont de functionaliteit van een amplificatie microarray met een MDR-TB microarray test voor rpoB (30 mutaties), KATG (2 mutaties), inha (4 mutaties), rpsL (2 mutaties), embB (1 mutatie), IS1245, IS6110 en een interne amplificatie en hybridisatie controle. Ten minste een matched pair van microarray probes (wild-type (WT) en single-nucleotide mutant (MU)) is opgenomen voor elke mutatie van belang. Gezuiverde nucleïnezuren uit multiresistente M. tuberculose van de TDR Tuberculose Strain Bank 31. Gel element microarrays worden geproduceerd op glassubstraten door copolymerisatie hoofdzaak zoals elders 32 beschreven, behalve dat we 4% monomeer en 0,05 mM elke probe in de polymerizatie mengsel. Arrays zijn omgeven met een 50 ml pakking voor gebruik. Na thermische cycli, hybridisatie en wassen stappen, zijn versterking microarrays afgebeeld op een Akonni draagbare analyzer. -Achtergrond gecorrigeerde, geïntegreerde signaal intensiteiten worden verkregen uit de ruwe. Tif beelden met behulp van een vaste cirkel algoritme. Noise elk gel-element wordt berekend als drie maal de standaardafwijking van de lokale plek achtergronden. Gendoelstellingen worden doorgaans beschouwd detecteerbaar voor signaal-ruisverhouding (SNR)-waarden ≥ 3. Om de aanwezigheid of afwezigheid van een specifieke mutatie in elk gen of codon bepalen, wordt een discriminant verhouding berekend uit de SNR waarden (WT-MU) / (WT + MU). Discriminant verhoudingen <0 zijn indicatief voor een resistentie mutatie op de locus, terwijl verhoudingen> 0 zijn aanwijzingen voor de wild-type sequentie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De omvang van multiplexing met een amplificatie microarray wordt uiteindelijk bepaald door de efficiëntie van multiplex asymmetrische PCR, niet de microarray. In onze ervaring, kan 10-12 unieke primer paren gemakkelijk worden multiplexfunctionaliteit een amplificatie microarray-formaat. Conventionele primer en probe ontwerpcriteria gelden derhalve nieuwe assays, behalve dat men moet ook potentiële interacties tussen oplossing-fase nucleïnezuren en microarray geïmmobiliseerde probes, het thermisch rendement van de th…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) onder toekenning RC3 AI089106.
MDR-TB nucleïnezuren werden verstrekt door het Fonds / United Nations Development Programme / Wereldbank / World Health Organization speciale programma het Kinderfonds van de Verenigde Naties voor Onderzoek en Opleiding in Tropische Ziekten (TDR), Genève, Zwitserland.
Wij danken dr. Tom Shinnick van de Amerikaanse Centers for Disease Control en Prevention voor begeleiding op de specifieke genen en mutaties in de prototype-test op te nemen.
Materials
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
Riferimenti
- Lemaire, J. -. F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
- World Health Organization. . Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
- Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
- Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
- Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
- Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
- Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
- Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
- Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
- Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
- Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
- Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
- Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
- Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
- Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
- Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
- Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
- Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
- Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
- Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
- Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
- Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
- Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
- Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
- Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
- Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
- Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
- Sekiguchi, J. -. I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
- Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
- Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
- Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
- Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
- Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
- Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
