Demonstration af en multiresistent<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Forstærkning Microarray
Summary
En forstærkning microarray kombinerer asymmetrisk PCR-amplifikation og microarray hybridisering i et enkelt kammer, som i væsentlig grad effektiviserer microarray workflow for slutbrugeren. Forenkling microarray workflow er et nødvendigt første skridt for at skabe microarray-baseret diagnostik, som kan anvendes rutinemæssigt i lavere ressource-miljøer.
Abstract
Forenkling microarray workflow er et nødvendigt første skridt for at skabe MDR-TB microarray-baseret diagnostik, som kan anvendes rutinemæssigt i lavere ressource-miljøer. En forstærkning microarray kombinerer asymmetrisk PCR forstærkning, valg af mål størrelse, target mærkning og microarray hybridisering inden for en enkelt løsning, og i en enkelt mikrofluid kammer. Et parti forarbejdningsmetode demonstreres med en 9-plex asymmetrisk mester mix og low-density gel element microarray til genotypebestemmelse multiresistent Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). Den her beskrevne protokol kan være afsluttet i 6 timer og give korrekte genotypebestemmelse med mindst 1.000 celleækvivalenter af genomisk DNA. Integrering af on-chip vasketrin er muligt, hvilket vil resultere i en helt lukket amplikon fremgangsmåde og system. Omfanget af multiplexing med en forstærkning microarray sidste ende begrænset af antallet af primerpar, der kan kombineres i en enkelt master mix og stadig opnå den ønskede følsomhed og specificitet effektivitetsmålinger, snarere end antallet af prober, der er immobiliseret på array. Ligeledes kan den samlede analyse forkortes eller forlænges afhængigt af den specifikke tilsigtede anvendelse, forskning spørgsmål, og ønskede detektionsgrænser. Ikke desto mindre er den generelle tilgang betydeligt strømliner microarray workflow for slutbrugeren ved at reducere antallet af manuelt intensive og tidskrævende procestrin, og giver en forenklet biokemisk og mikrofluid vej for at omsætte microarray-baseret diagnostik i rutinemæssig klinisk praksis.
Introduction
Tidlig opsporing af tilfælde og hurtig behandling der betragtes som de mest effektive bekæmpelsesstrategier til at reducere Mycobacterium tuberculosis (MTB) transmission 1, og der er nu bred enighed i TB samfund, et point of care (POC) eller i nærheden af POC test til samtidigt at diagnosticere TB og resistens (DR) er nødvendig. Teknologier såsom Cepheid s GeneXpert og andre nukleinsyreamplifikation test reducere tiden til diagnose for mange TB-patienter og tilvejebringe en hurtig udlæsning angiver resistens over for rifampin eller valgte mutationer, der giver resistens over for andre første eller anden linje lægemidler 2. Selv realtid og thermo nukleinsyreamplifikation tests er designet til at identificere drug resistente mutationer, der fører til MDR-TB, spektret af mutationer de opdager ofte er utilstrækkelig til at designe en individualiseret medicin regime svarende til resistens profil af patienten, og tekniske begrænsninger i forholdtil optisk cross-talk eller kompleksiteten af amplifikations og rapportering kemi 3-7 Maj begrænse antallet af loci eller mutationer, der opdages. Således er detektionsteknologier med højere multiplexing kapacitet, der kræves for at løse kendte huller i MDR-TB POC diagnostik.
Microarrays og WHO-godkendt Hain line probeassays kan løse "multiple gen, flere mutationer" udfordring at diagnosticere MDR-TB 8-29. Desværre er disse hybridisering-baserede, multiplexede detektion platforme benytter multistep, kompliceret, og open-amplicon protokoller, der kræver væsentlig uddannelse og erfaring på molekylære teknikker. Forstærkningen microarray 30 var designet til at løse nogle af disse microarray work-flow og operationelle bekymringer. De forenklede fluidstyrede principper er at uddybe, hybridisere, og opdage nukleinsyremål inden for en enkelt mikrofluid kammer. Brugeren indfører nukleinsyre-og amplifikationsprodukter master blandes i en strømningsteknisk kammer med en pipette og starter termisk cykling protokollen. Batch forarbejdningsmetode er vist her, er microarrays efterfølgende vasket i bulk-opløsning, tørret og afbildes. Denne undersøgelse viser funktionaliteten af en forstærkning microarray ved hjælp af en MDR-TB microarray test for rpoB (30 mutationer), katG (2 mutationer), inhA (4 mutationer), rpsL (2 mutationer), embB (1 mutation), IS1245, IS6110 , og en intern forstærkning og hybridisering kontrol. Mindst én matchede par af microarray sonder (vildtype (WT) og enkelt-nukleotid mutant (MU)) er medtaget for hver mutation af interesse. Rensede nukleinsyrer fra multiresistent M. tuberkulose er fra TDR Tuberkulose Strain Bank 31. Gel element microarrays fremstilles på glas substrater ved copolymerisation væsentlige som beskrevet andetsteds 32, bortset fra at vi bruger 4% monomer og 0,05 mM hver sonde i polymeriztion blanding. Arrays er omgivet med en 50 ml pakning før anvendelse. Efter termisk cykling, hybridisering og vasketrin er amplifikationsprodukter microarrays afbildet på en Akonni bærbar analysator. Baggrund-korrigeret, integrerede signalintensiteter fås fra rå. Tif billeder ved hjælp af en fast cirkel algoritme. Støj for hver gel element beregnes som tre gange standardafvigelsen af de lokale spot baggrunde. Genmål opfattes typisk som påvises i signal-støjforholdet (SNR) værdier ≥ 3. For at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af en specifik mutation i hvert gen eller codon er en diskriminant beregnede forhold fra SNR værdier som (WT-MU) / (WT + MU). Diskriminant forhold <0 er indikative for et lægemiddel-resistens-mutation ved locuset, mens forhold> 0 er indikative for vildtypesekvensen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omfanget af multiplexing med en forstærkning microarray sidste ende dikteret af effektiviteten af multiplex asymmetrisk PCR, ikke microarray. Det er vores erfaring, kan 10-12 unikke primerpar let multiplex i en forstærkning microarray-format. Konventionelle primer og probe design kriterier gælder derfor for nye assays, bortset fra at man også må overveje mulige interaktioner mellem opløsningsfase-nukleinsyrer og immobiliserede microarray prober, den termiske virkningsgrad af termiske cykler, og probehybridis…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) under tilskud RC3 AI089106.
MDR-TB nukleinsyrer blev leveret af De Forenede Nationers Børnefond / United Nations Development Programme / Verdensbanken / World Health Organization særlige program for forskning og uddannelse i tropesygdomme (TDR), Genève, Schweiz.
Vi takker Dr. Tom Shinnick af det amerikanske Centers for Disease Control og Forebyggelse for vejledning om de specifikke gener og mutationer at medtage i prototypen analysen.
Materials
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
Riferimenti
- Lemaire, J. -. F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
- World Health Organization. . Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
- Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
- Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
- Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
- Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
- Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
- Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
- Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
- Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
- Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
- Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
- Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
- Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
- Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
- Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
- Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
- Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
- Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
- Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
- Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
- Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
- Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
- Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
- Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
- Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
- Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
- Sekiguchi, J. -. I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
- Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
- Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
- Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
- Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
- Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
- Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
