Demostración de un resistente a múltiples fármacos<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Microarray Amplificación
Summary
Un microarray de la amplificación de PCR asimétrica combina la amplificación y la hibridación de microarrays en una sola cámara, lo que simplifica significativamente microarrays de flujo de trabajo para el usuario final. La simplificación de los microarrays de flujo de trabajo es un primer paso necesario para la creación de diagnósticos basados en microarrays que se pueden utilizar de forma rutinaria en los entornos más bajos recursos.
Abstract
La simplificación de los microarrays de flujo de trabajo es un primer paso necesario para la creación de la MDR-TB diagnósticos basados en microarrays que se pueden utilizar de forma rutinaria en los entornos de bajo recursos. Un microarray amplificación combina la amplificación asimétrica PCR, la selección de tamaño de destino, objetivo de etiquetado y la hibridación de microarrays en una única solución y en una sola cámara de microfluidos. Un método de procesamiento por lotes se demuestra con una mezcla maestra asimétrica 9 compleja y de baja densidad elemento gel microarray para el genotipado de múltiples fármacos de Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). El protocolo descrito aquí se puede completar en 6 horas y proporcionar genotipado correcto con al menos 1000 equivalentes celulares de ADN genómico. La incorporación en el chip pasos de lavado es viable, lo que resultará en un método de amplificación totalmente cerrado y el sistema. La medida de multiplexación con una micromatriz de amplificación se ve limitada en última instancia por el número de pares de cebadores que se pueden combinar en un único maestro mIX y aún así lograr la sensibilidad deseada y métricas de rendimiento especificidad, en lugar del número de sondas que están inmovilizados en la matriz. Del mismo modo, el tiempo total de análisis se puede acortar o alargar dependiendo del uso específico previsto, pregunta de investigación, y los límites de detección deseado. Sin embargo, el enfoque general simplifica significativamente microarrays de flujo de trabajo para el usuario final, reduciendo el número de pasos manualmente intensivos y que consumen mucho tiempo de procesamiento, y proporciona un camino bioquímico y de microfluidos simplificado para la traducción de diagnósticos basados en microarrays en la práctica clínica de rutina.
Introduction
La detección temprana de los casos y el tratamiento rápido se consideran las estrategias de control más eficaces de reducir el Mycobacterium tuberculosis (MTB) de transmisión de 1, y existe un amplio consenso en la comunidad TB que un punto de atención (PDA) o cerca de la prueba POC para diagnosticar simultáneamente TB y se necesita resistencia a los medicamentos (DR). Tecnologías tales como GeneXpert de Cepheid y otras pruebas de amplificación de ácidos nucleicos reducen el tiempo de diagnóstico para muchos pacientes de TB, y proporcionan una rápida lectura de salida que indica la resistencia a la rifampicina o mutaciones seleccionadas que confieren resistencia a otros fármacos de línea primero o segundo 2. Aunque las pruebas de amplificación en tiempo real y de ácidos nucleicos isotérmica están diseñadas para identificar las mutaciones de resistencia a las drogas que llevan a la MDR-TB, el espectro de mutaciones se detectan es a menudo insuficiente para diseñar un régimen individualizado de drogas correspondiente al perfil de resistencia a los medicamentos del paciente, y las limitaciones técnicas relacionadasa la diafonía óptica o la complejidad de la amplificación y de información química 3 a 7 may limitar el número de loci o mutaciones que se detectan. Por lo tanto, se requieren tecnologías de detección con mayor capacidad de multiplexación para subsanar las deficiencias conocidas en el diagnóstico POC MDR-TB.
Microarrays y los ensayos con sondas de línea Hain avaladas por la OMS pueden hacer frente a la "múltiples genes, mutaciones múltiples" reto de diagnosticar la TB-MR 8-29. Por desgracia, estas plataformas de detección de multiplexado basado en la hibridación utilizan múltiples pasos, complicado y protocolos de amplificación de voces que exigen la formación y la competencia significativa en las técnicas moleculares. El microarray de amplificación 30 fue diseñado para hacer frente a algunos de estos microarrays de flujo de trabajo y las preocupaciones operacionales. Los principios de fluidos simplificadoras son para amplificar, hibridar, y detectar dianas de ácido nucleico dentro de una cámara única de microfluidos. El usuario introduce los mas ácidos nucleicos y amplificaciónter la mezcla en una cámara de fluido con una pipeta y se inicia el protocolo de ciclado térmico. Para el método de procesamiento por lotes que se muestra aquí, los microarrays se lavan posteriormente en solución en masa, se secaron, y la imagen. Este estudio demuestra la funcionalidad de un microarray de amplificación utilizando una prueba de MDR-TB de microarrays para rpoB (30 mutaciones), katG (2 mutaciones), inh (4 mutaciones), rpsL (2 mutaciones), embB (1 mutación), IS1245, IS6110 , y una amplificación interna y el control de hibridación. Al menos un par emparejado de microarrays sondas (de tipo salvaje (WT) y mutantes de un solo nucleótido (MU)) se incluye para cada mutación de interés. Ácidos nucleicos purificados a partir de M. resistente a múltiples fármacos tuberculosis son de la cepa TDR Tuberculosis Banco 31. Microarrays de elemento en gel se fabrican sobre substratos de vidrio por copolimerización esencialmente como se describe en otra parte 32, excepto que se utiliza 4% de monómero y 0,05 mM de cada sonda en el polimerizablesmezcla ación. Las matrices están rodeados con una junta de 50 ml antes de su uso. Después de ciclos térmicos, de hibridación y de lavado de pasos, microarrays de amplificación se crean imágenes en un analizador portátil Akonni. , La intensidad de señal integrados antecedentes corregido se obtienen de la prima. Imágenes tif utilizando un algoritmo círculo fijo. De ruido para cada elemento de gel se calcula como tres veces la desviación estándar de los fondos contado locales. Objetivos de genes típicamente se consideran detectables durante la relación señal-ruido (SNR) valores ≥ 3. Con el fin de determinar la presencia o ausencia de una mutación específica en cada gen o codón, una relación discriminante se calcula a partir de los valores de SNR como (WT-MU) / (wt + MU). Ratios de discriminantes <0 son indicativos de una mutación de resistencia a fármacos en el locus, mientras que las relaciones> 0 son indicativos de la secuencia de tipo salvaje.
Protocol
Representative Results
Discussion
La medida de multiplexación con una micromatriz de amplificación es dictado en última instancia por la eficiencia de la PCR asimétrica múltiplex, no el microarray. En nuestra experiencia, 10 a 12 pares de cebadores únicos pueden ser multiplexados fácilmente en un formato de microarrays de amplificación. Por lo tanto, criterios de cebador y sonda de diseño convencionales se aplican a los nuevos ensayos, excepto que también se debe tener en cuenta las posibles interacciones entre ácidos nucleicos en fase de sol…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta labor fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) en AI089106 RC3 subvención.
Ácidos nucleicos MDR-TB fueron proporcionados por / Programa Especial de las Naciones Unidas para el Fondo / Naciones Unidas para el Desarrollo del Banco Mundial / Organización Mundial de la Salud para la Investigación y Capacitación en Enfermedades Tropicales (TDR), Ginebra, Suiza.
Agradecemos al Dr. Tom Shinnick de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de orientación sobre los genes y las mutaciones específicas para incluir en el ensayo de prototipos.
Materials
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
Riferimenti
- Lemaire, J. -. F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
- World Health Organization. . Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
- Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
- Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
- Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
- Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
- Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
- Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
- Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
- Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
- Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
- Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
- Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
- Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
- Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
- Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
- Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
- Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
- Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
- Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
- Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
- Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
- Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
- Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
- Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
- Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
- Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
- Sekiguchi, J. -. I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
- Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
- Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
- Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
- Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
- Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
- Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
