הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח
Summary
מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.
Abstract
למרות של זמן קצר, מיטוזה היא תהליך רב שלבים מורכב ודינמי בסיסי להתפתחות של איברים, כולל המוח. בפיתוח קליפת המוח, מיטוזה חריגה של אבות עצביים יכולה לגרום למומים בגודל המוח ותפקודו. לפיכך, יש צורך קריטי בכלים להבין את המנגנונים של מיטוזה העצבית. התפתחות קליפת המוח במכרסמים היא מודל יוצא דופן ללימוד התהליך הזה. מיטוזה העצבית נבחנה בדרך כלל בחלקים במוח קבועים. פרוטוקול זה יתאר בפירוט גישה להדמית חיה של מיטוזה בvivo לשעבר פרוסות מוח עובריים. נתאר את השלבים הקריטיים בהליך זה, הכולל: שאיבת מוח, הטבעת מוח, חתך vibratome של פרוסות מוח, מכתים וculturing של פרוסות, וזמן לשגות הדמיה. אז תוכל להפגין ולתאר בפירוט כיצד לבצע ניתוח שלאחר הרכישה של מיטוזה. אנו כוללים fr תוצאות נציגאום assay זה באמצעות הצבע Syto11 החיוני, עכברים הטרנסגניים (היסטון H2B-EGFP וcentrin-EGFP), וelectroporation ברחם (mCherry-α-טובולין). נדון כיצד הליך זה יכול להיות מותאם הכי טוב ואיך זה יכול להיות שונה למחקר של רגולציה הגנטית של מיטוזה. הדמיה חיה של מיטוזה בפרוסות מוח היא גישה גמישה על מנת להעריך את ההשפעה של גיל, אנטומיה, והפרעות גנטיות בסביבה מבוקרת, ולייצר כמות גדולה של נתונים ברזולוציה של זמן ומרחב גבוה. מכאן פרוטוקול זה ישלים כלים קיימים לניתוח של מיטוזה העצבית.
Introduction
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לתאר כיצד לבצע הדמיה חיה של מיטוזה העצבית בפרוסות מוח עובריים. באמצעות הדמיה חיה של פרוסות מוח בתרבות, פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה לassay היבטים רבים של מיטוזה בתאי אב עצבי בסביבה דומה מאוד להגדרת in vivo. זה יכול להיות מיושם על מוחם של בעלי חיים שעברו מוטציה ו / או מוח שעברו מניפולציה עם electroporation ברחם) 1-5. טכניקה זו היא גם אידיאלית כדי לבחון את ההשפעה של סוכנים תרופתיים במיטוזה 'המבשרים עצביים, פשוט על ידי הוספת סוכן למדיום לתרבות. לסיכום, במאמר זה להפוך את פרוטוקול מאתגר מבחינה טכנית נגיש ללומדי נוירוגנזה.
במהלך נוירוגנזה, אוכלוסיות עצביות שונות לעבור חטיבות מדויקות כדי לייצר נוירונים שסופו של דבר יתרמו לשש שכבות בקליפת המוח של המבוגרים הניאוקורטקס 6-8. בשלב מוקדם בהתפתחות קליפת המוח, הבריכה העצבית המבשרת מתרחבת כneuroepithelial תאים (NE) לחלק באופן סימטרי לחידוש עצמי. תאי NE לאחר מכן להמיר לתאי גלייה רדיאלי (RGCs). בתחילה RGCs לחלק באופן סימטרי כדי לייצר שתי RGCs החדש, לעומת זאת בחלק הארי של נוירוגנזה, המצב העיקרי 'RGCs של החלוקה הוא סימטרי. בחלוקה סימטרית, 1 RGC מוליד RGC חדש וגם נוירון לאחר mitotic, או אב מתמחה יותר (או מבשר קצר עצבי (SNP), גליה חיצונית רדיאלי (ORG), או אב ביניים (INP) 2,3,7,9. INPS, SNPs, וorgs אז ניתן להפיק תאי עצב בתת חדרית, חדרית, ואזורי בסיס של קליפת המוח, בהתאמה. לפיכך, חלוקת תא של אבות הוא תהליך בסיסי ליצירת נוירונים של קליפת מוח.
מחקרים רבים מצביעים על קשר בין תכונות ספציפיות mitotic של RGCs וגורלם של תאי בת. חיידר ואח'. ואל טקהאשי et.הראו כי משך המיטוטי RGC ולהגדיל את אורך מחזור התא כתמורת נוירוגנזה, ממצא הדהד במעקב מחקרים 10-13. מספר המחקרים הציעו כי ציר mitotic אורינטציה ביחס לחדר משפיע על היבטי הנוירוגנזה וcorticogenesis, כוללים סוגים של נוירונים שנוצרו ומיקום של צאצאים במוח, בהתאמה 3,10,14-16. האם נטייה מטוס המחשוף משפיעה ישירות על גורל תא הוא שנוי במחלוקת, אבל המסקנה היא שנוירוגנזה משפיע פרמטר המיטוטי זה. יתר על כן מדגישה את החשיבות של מיטוזה היא התצפית כי גנים רבים המעורבים במכניקה של מיטוזה הם קריטיים עבור הנוירוגנזה להתפתחות מוח תקינה 17-20.
מיטוזה היא תהליך דינמי, אך עד כה רוב המחקרים המפרטים מיטוזה העצבית לנצל ניתוח של סעיפים קבועים רקמה או הדמיה של אבות עצביים באמצעות תרבית תאים במבחנה. לכן, שיטות הזרם המרכזי כדי להעריך מיטוזה רק לספק תמונת מצב של תהליך זה ולא מצליחים לגלות כיצד תאים להתנהג ברקמות. הדמיה חיה של מיטוזה העצבית הפכה יותר ויותר כלי קריטי להבנת תפקוד עצבי. לדוגמאות ראו אזכור אלה 4,8,10,21-25. כמה פרוטוקולים מצטיינים כבר פורסמו לעריכה ולהדמיה של פרוסות מוח 26,27. עם זאת נכון להיום, פרוטוקול מקיף להדמיה וניתוח של מיטוזה לא תואר ולא הוכיח בוידאו.
טכניקה זו מציעה כמה יתרונות משמעותיים על פני ניתוח קבוע של חלקים במוח. ניתוח זמן לשגות של פרוסות המוח מאפשר דור של באופן משמעותי יותר נקודות נתונים שיכולים להיות מנותח באופן גמיש. ראשית, הנתונים שנאספו בנקודות זמן בודדות במהלך כמה דקות או כמה שעות. אפשר לנתח את נקודות זמן בודדות (כדי ליצור מונטאז' סטטית) אוניתן לשלב נקודות זמן שונות לסרטים. שנית, ההדמיה confocal של פרוסות מאפשרת דור של נתונים בסעיפי Z שונים בפרוסות מוח. כתוצאה מכך, ניתן לנתח קטעים בודדים. לחלופין, ערימות של חלקים בודדים ניתן לשלב הקרנת עוצמה מקסימלית. שלישית, ניתוח נעשה בהקשר של רקמה, וחושף כיצד תאים מתחלקים ביחס לתאים ומבנים שכנים. רביעית, הוא אידיאלי לניתוח מוטציות שמראות כמה עדויות של פגמים mitotic. יחד פרוטוקול זה יעזור להבהיר את השלבים קריטיים כדי לסייע לחוקרים המבקשים לבצע הדמיה חיה של מיטוזה העצבית במעבדות שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרון העיקרי של הפרוטוקול שתארנו הוא שהיא מספקת פתרון זמני דינמי של מיטוזה של אבות עצביים. בדרך כלל, מבחני לדמיין מיטוזה במוח המתפתח מבוצעים באמצעות immunofluorescence של חלקי רקמות קבועים. אך גישה זו מספקת רק תמונת מצב של מיטוזה בנקודת זמן אחת.
<p class="jove_content" style=";text-align:right;di…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים מימון NINDS / NIH, r00-NS064197 וNINDS / NIH, R01NS083897 (שניהם לDLS).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
| 2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
| syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| spatula | to transfer brains | ||
| paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
Riferimenti
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
- Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
- LoTurco, J. J., Manent, J. -. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
- Wang, X., Tsai, J. -. W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
- Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Pilaz, L. -. J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
- Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
- Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
- Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
- Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
- Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
- Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
- Hu, D. J. -. K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
- Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
- Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
- Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
- Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
- Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
- Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).
