التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء
Summary
العصبية السلف الانقسام هو معلمة الحرجة من تكوين الخلايا العصبية. ويستند جزء كبير من فهمنا لالعصبية السلف الانقسام على تحليل الأنسجة الثابتة. تصوير حي في شرائح المخ الجنينية هي تقنية متعددة لتقييم الانقسام مع القرار الزماني والمكاني عالية في بيئة تسيطر عليها.
Abstract
على الرغم من مدة قصيرة، الانقسام هو عملية متعددة الخطوات المعقدة والديناميكية الأساسية لتطوير القدرات للأجهزة بما في ذلك الدماغ. في القشرة الدماغية النامية، الانقسام الشاذ من الأسلاف العصبية يمكن أن يسبب تشوهات في حجم الدماغ ووظيفته. وبالتالي، هناك حاجة ماسة لأدوات لفهم الآليات العصبية السلف من الانقسام. التنمية القشرية في القوارض هو نموذج متميز لدراسة هذه العملية. يتم فحص العصبية السلف الانقسام عادة في أقسام الدماغ ثابتة. وهذا البروتوكول يصف بالتفصيل نهجا لتصوير حي من الانقسام في فيفو السابقين شرائح الدماغ الجنينية. سنقوم بشرح الخطوات الحاسمة لهذا الإجراء، والتي تشمل: استخراج الدماغ، الدماغ التضمين، باجتزاء vibratome من شرائح الدماغ، وتلطيخ وزراعة شرائح، والوقت الفاصل بين التصوير. وسوف نقوم بعد ذلك التظاهر وتصف بالتفصيل كيفية إجراء تحليل بعد الحيازة من الانقسام. ندرج نتائج ممثل الابام هذا الاختبار باستخدام الصبغة Syto11 الحيوية، الفئران المعدلة وراثيا (هيستون H2B-EGFP وcentrin-EGFP)، والتثقيب الكهربائي في الرحم (mCherry-α-تويولين). سوف نناقش كيف أن هذا الإجراء يمكن أن يكون أفضل الأمثل وكيف يمكن تعديلها لدراسة التنظيم الجيني للالانقسام. تصوير حي من الانقسام في شرائح الدماغ هو نهج مرن لتقييم أثر من العمر، وعلم التشريح، واضطراب وراثي في بيئة تسيطر عليها، وإلى توليد كمية كبيرة من البيانات مع القرار الزماني والمكاني عالية. وبالتالي هذا البروتوكول سوف تكمل الأدوات الموجودة لتحليل العصبية السلف الانقسام.
Introduction
الهدف العام من هذا البروتوكول هو لوصف كيفية إجراء التصوير الحي من العصبية السلف الانقسام في شرائح المخ الجنينية. باستخدام التصوير حية من شرائح الدماغ في الثقافة، هذا البروتوكول يوفر طريقة بسيطة لفحص جوانب متعددة من الانقسام في الأسلاف العصبية في بيئة مشابهة للغاية للبيئة في الجسم الحي. ويمكن تطبيقه لأدمغة الحيوانات و / أو متحولة العقول التي تم التلاعب بها في الرحم مع التثقيب الكهربائي) 1-5. هذه التقنية هي أيضا مثالية لاختبار تأثير كلاء الدوائية على الانقسام السلائف العصبية '، ببساطة عن طريق إضافة وكيل لثقافة المتوسط. باختصار، هذه المادة سوف تجعل بروتوكول تحديا تقنيا للوصول إلى أولئك الذين يدرسون تكوين الخلايا العصبية.
أثناء تكوين الخلايا العصبية، متميزة السكان السلف العصبية الخضوع الانقسامات دقيقة لتوليد الخلايا العصبية التي تسهم في نهاية المطاف إلى الطبقات القشرية ستة من الكبار القشرة المخية الحديثة 6-8. في التنمية القشرية في وقت مبكر، ويوسع تجمع السلائف العصبية الظهارية العصبية كما (NE) انقسام الخلايا بشكل متناظر على تجديد الذات. خلايا NE ثم تحويلها إلى خلايا الدبقية شعاعي (RGCs). في البداية RGCs تقسيم متناظر لإنتاج نوعين من RGCs جديدة، ولكن خلال الجزء الأكبر من تكوين الخلايا العصبية، الوسيلة الرئيسية لتقسيم RGCs 'غير متناظرة. في التقسيم غير المتماثلة، 1 RGC يثير RGC جديدة وإما الخلايا العصبية بعد الإنقسامية، أو السلف أكثر تخصصا (إما السلائف العصبية القصيرة (SNP)، وهو الدبقية شعاعي الخارجي (ORG)، أو السلف المتوسطة (INP) 2،3،7،9. INPS، تعدد الأشكال، ويمكن بعد ذلك ORGs توليد الخلايا العصبية في البطين الفرعية، البطين، والمناطق القاعدية من القشرة، على التوالي، وبالتالي فإن انقسام الخلايا من الأسلاف هو عملية أساسية لتوليد الخلايا العصبية لل القشرة المخية الحديثة.
تشير العديد من الدراسات إلى وجود علاقة بين الصفات الإنقسامية محددة من RGCs ومصير الخلايا الوليدة. حيدر وآخرون. وتاكاهاشي وآخرون.قد أظهرت أن RGC مدة الإنقسامية دورة الخلية وزيادة طول والعائدات تكوين الخلايا العصبية، وردد وهو الاكتشاف في متابعة الدراسات 10-13. وقد اقترح عدد من الدراسات التي المغزل الإنقسامية التوجه النسبي إلى البطين يؤثر جوانب تكوين الخلايا العصبية وcorticogenesis، بما في ذلك أنواع من الخلايا العصبية ولدت وموقع ذرية في الدماغ، على التوالي 3،10،14-16. ما إذا كان التوجه الطائرة الانقسام يؤثر بشكل مباشر مصير الخلية مثير للجدل، ولكن يبقى الاستنتاج بأن هذه الآثار الإنقسامية المعلمة تكوين الخلايا العصبية. مزيد من التأكيد على أهمية الانقسام هو ملاحظة أن العديد من الجينات المعنية في اليات الانقسام حاسمة لتكوين الخلايا العصبية والدماغ السليم للتنمية 17-20.
الانقسام هو عملية ديناميكية، ولكن حتى الآن معظم الدراسات تفصيل العصبية السلف الانقسام الاستفادة من تحليل المقاطع النسيجية ثابتة أو التصوير من الأسلاف العصبية عن طريق زراعة الخلايا في المختبر. وبالتالي، فإن الأساليب السائدة لتقييم الانقسام توفر سوى لقطة من هذه العملية وتفشل في الكشف عن كيف تتصرف الخلايا في الأنسجة. أصبح التصوير الحي من العصبية السلف الانقسام بشكل متزايد أداة حاسمة لفهم وظيفة السلف العصبية. للحصول على أمثلة يرجى الاطلاع على هذه المراجع 4،8،10،21-25. وقد نشرت العديد من البروتوكولات غير المسددة لإعداد وتصوير شرائح الدماغ 26،27. ولكن حتى الآن، لم يتم وصفها بروتوكول شامل للتصوير وتحليل الانقسام ولا أظهر في الفيديو.
هذا الأسلوب يوفر عدة مزايا هامة على تحليل ثابت من أقسام الدماغ. تحليل الوقت الفاصل بين شرائح الدماغ تمكن جيل من أكثر بكثير من نقاط البيانات التي يمكن تحليلها بطريقة مرنة. أولا، يتم جمع البيانات في نقطة زمنية الفردية على مدى عدة دقائق أو عدة ساعات. يمكن للمرء أن تحليل نقاط زمنية الفردية (لإنشاء المونتاج ثابت) أولا يمكن الجمع بين نقاط زمنية مختلفة في الأفلام. الثانية، والتصوير متحد البؤر من شرائح تمكن الجيل من البيانات في أقسام مختلفة Z في شرائح الدماغ. ونتيجة لذلك، يمكن تحليل المقاطع الفردية. بدلا من ذلك، أكوام من المقاطع الفردية يمكن دمجها في الإسقاط كثافة اكبر. الثالثة، ويتم التحليل في سياق الأنسجة، وكشف عن كيفية تقسيم الخلايا نسبة إلى الخلايا والهياكل المجاورة. الرابعة، هي مناسبة بشكل مثالي لتحليل المسوخ التي تظهر بعض الأدلة على عيوب الإنقسامية. معا هذا البروتوكول سوف تساعد على توضيح الخطوات الحاسمة لمساعدة المحققين الذين يرغبون في إجراء التصوير الحي من العصبية السلف الانقسام في المختبرات الخاصة.
Protocol
Representative Results
Discussion
والميزة الرئيسية لبروتوكول وصفناها هو أنه يوفر القرار الزماني دينامية من الانقسام من الأسلاف العصبية. عادة، يتم تنفيذ المقايسات لتصور الانقسام في الدماغ النامية باستخدام المناعي من أقسام الأنسجة الثابتة. ولكن هذا النهج لا يوفر سوى لقطة من الانقسام في نقطة زمنية وا?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف الكتاب بتمويل من NINDS / NIH، R00-NS064197 NINDS و/ NIH، R01NS083897 (على حد سواء لدائرة الأراضي والمساحة).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
| 2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
| syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| spatula | to transfer brains | ||
| paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
Riferimenti
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
- Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
- LoTurco, J. J., Manent, J. -. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
- Wang, X., Tsai, J. -. W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
- Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Pilaz, L. -. J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
- Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
- Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
- Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
- Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
- Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
- Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
- Hu, D. J. -. K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
- Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
- Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
- Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
- Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
- Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
- Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).
