Etiquetado de la célula y de inyección en Desarrollo de embriones de ratón Corazones
Summary
Se describe una serie de métodos para inyectar colorantes, vectores de ADN, virus, y células con el fin de supervisar tanto el destino celular y el fenotipo de las células endógenas y injertados derivados de células embrionarias o pluripotentes dentro de embriones de ratón en el día embrionario (E) 9,5 y etapas posteriores de desarrollo.
Abstract
Probando el destino de la célula de vástago derivados embrionarios o pluripotentes en protocolos in vitro ha conducido a resultados controvertidos que no reflejan necesariamente su potencial in vivo. Preferiblemente, estas células deben ser colocados en un entorno embrionario adecuado con el fin de adquirir su fenotipo definido. Por otra parte, el linaje celular rastreo estudios en el ratón después de etiquetar las células con colorantes o vectores retrovirales se ha mantenido mayormente limitada a los embriones de ratón en fase inicial con los órganos todavía poco desarrollados. Para superar estas limitaciones, hemos diseñado protocolos de microinyección estándar y de ultrasonido mediada para inyectar diversos agentes en regiones específicas del corazón en embriones de ratón en E9.5 y etapas posteriores del desarrollo. Explante embrionarias o embriones se cultivan o hacia la izquierda para seguir desarrollando en el útero. Estos agentes incluyen los tintes fluorescentes, virus, shRNAs, o las células madre derivadas de células progenitoras. Nuestros enfoques permiten la preservación de la funciones del órgano mientras se monitorea la migración y el destino de las células marcadas y / o inyectados. Estas tecnologías pueden extenderse a otros órganos y va a ser muy útil para hacer frente a cuestiones biológicas fundamentales en la biología del desarrollo.
Introduction
Hace más de una década, las células madre embrionarias humanas (HuESCs) se han derivado de blastocistos humanos 1. Desde entonces, estas células han sido objeto de un importante campo de investigación que se ocupa de las cuestiones no cubiertas en la biología del desarrollo humano. HuESCs han proporcionado, además, las esperanzas en la medicina regenerativa. En los últimos años, las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs humanos) se han generado a partir de células somáticas específicas del paciente, proporcionando modelos de enfermedad genética 2. Muchos en los protocolos in vitro para la diferenciación de células madre embrionarias pluripotentes inducidas o hacia diferentes linajes de células, incluyendo los linajes del corazón 3, han sido reportados. Las células diferenciadas son a menudo fenotipados por análisis de ARN y la expresión de proteínas, inmunotinción, y / o en las pruebas funcionales in vitro. Sin embargo, los derivados de células madre pluripotentes tienen que ser colocados en un entorno embrionario adecuado con el fin de probar si adquieren plenamente la CELl destino de su contraparte embrionario y si recapitulan la función genuina en vivo en respuesta a las señales regionales. Mientras que la ingeniería de tejidos es prometedor, aún no ofrece todas las señales conocidas y desconocidas de la adecuada in vivo el tejido embrionario en desarrollo 4,5.
Etiquetado celular con tintes o vectores retrovirales en los embriones, incluyendo embriones de ratón, han traído información importante sobre el origen embrionario de los linajes de células durante el desarrollo cardíaco 6. Por ejemplo, la inyección de colorante en el espacio pericárdico de embriones de ratón ex vivo, seguido por cultivo in vitro de corazones aislados, se utilizó para marcar las células epicárdicas y sus descendientes 7. Sin embargo, el tinte y el etiquetado de células retroviral se han aplicado sobre todo a los embriones tempranos de ratón con órganos aún poco desarrolladas, o embriones de pollo, que son de más fácil acceso 8. Una excepción es el cerebro, que es más fácil de apuntar en la direcciónmbryos 9,10. Este enfoque aún no se ha aplicado a la superando corazón embrionario de ratón.
Para complementar el marcaje directo con tintes o virus y para realizar el seguimiento en el linaje más avanzados embriones de ratón de la etapa y ratones adultos, el mecanismo de etiquetado de células se ha combinado con el análisis de los ratones transgénicos usando la tecnología Cre / Lox. El enfoque de Cre / Lox 11 sin embargo ofrece algunas limitaciones debido a la especificidad espacio-temporal de las regiones reguladoras genómicas utilizadas para dirigir la expresión de la recombinasa, y la eficiencia de la recombinación Cre / Lox 12. Además, este enfoque no aborda completamente las preguntas específicas de la adquisición de la migración impulsada por células de destino de la célula, ya que sólo puede etiquetar un precursor después de la activación de la región reguladora utilizada para conducir la expresión de Cre. También no se puede aplicar a los embriones humanos para cuestiones éticas obvias.
Teniendo en cuenta estas limitaciones, hemos diseñado una serie de nuevos protocolos para inyectar una variedad de agentes de marcaje de células, tales como colorantes fluorescentes, virus, moduladores de expresión de genes tales como shRNAs y vectores de etiquetado de células basadas en el ADN, o células en el embrión de ratón en E9.5 y etapas posteriores del desarrollo en regiones seleccionadas de la corazón.
Las inyecciones de ADN / celulares utilizan un microscopio estereoscópico y un dispositivo de microinyección sencillo con ex vivo el cultivo de embriones de hasta 48 horas, o el corazón aislado o cultivo de explantes de embriones de 48 a 72 h. Nos informan también un protocolo de microinyección por ultrasonidos mediado en ratón corazones embrionarios en el útero. Esta técnica permite monitorear el desarrollo de los embriones de 13 y permite un seguimiento a largo plazo de los injectates y / o células marcadas.
Hemos encontrado que estos enfoques preservar la función del órgano y proporcionan un entorno más representativo que las pruebas in vitro de potencial de células madre. También proporciona la oportunidad de seguir la migraciónde la etiqueta y / o inyectado células para controlar su destino. En última instancia, esto debería producir una mejor comprensión de los patrones de tejido regional y los procesos biológicos clave.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los in vivo protocolos intra-cardíacos ex inyección descritos anteriormente están diseñados para preservar la función miocárdica durante al menos 48 horas a mediados de la etapa (E9.5-E11.5 embriones de ratón). Estos enfoques de inyección permiten para inyección espacialmente selectiva de ADN o células. Los pocos ejemplos que se muestran en las figuras 1-3 proporcionan una prueba de concepto para delinear ex vivo e in vivo los mecanismos moleculares de los p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen la Fundación Leducq (mitral) y la Agence Nationale pour la Recherche (ANR conceder Specistem) para la financiación de esta investigación.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Altro | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
Riferimenti
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