Cellule étiquetage et l'injection dans le développement embryonnaires coeurs de souris
Summary
Nous décrivons une série de méthodes pour injecter des colorants, des vecteurs d'ADN, des virus et des cellules, afin de contrôler à la fois le destin des cellules et le phénotype des cellules endogènes et greffés dérivés de cellules embryonnaires ou pluripotentes à l'intérieur des embryons de souris au jour embryonnaire (E) de 9,5 et les étapes ultérieures de développement.
Abstract
Test du sort des souches cellulaires dérivés embryonnaires pluripotentes ou dans les protocoles in vitro a conduit à des résultats controversés qui ne reflètent pas nécessairement leur potentiel in vivo. De préférence, ces cellules doivent être placées dans un environnement approprié embryonnaire afin d'acquérir leur phénotype défini. En outre, la lignée cellulaire de traçage études chez la souris après marquage des cellules avec des colorants ou des vecteurs rétroviraux est resté la plupart du temps limitée à des embryons de souris à un stade précoce avec les organes encore peu développées. Pour surmonter ces limitations, nous avons conçu des protocoles de micro-injection standard et échographie médiation pour injecter différents agents dans les régions ciblées du cœur dans des embryons de souris à E9.5 et stades de développement. Explants ou embryons embryonnaires sont ensuite cultivées ou à gauche pour développer in utero. Ces agents comprennent des colorants fluorescents, des virus, des shRNA ou des cellules souches progénitrices dérivées de cellules. Nos approches permettent la préservation de la function de l'organe tout en surveillant la migration et le devenir des cellules marquées et / ou injectées. Ces technologies peuvent être étendues à d'autres organes et seront très utiles pour aborder des questions biologiques clés en biologie du développement.
Introduction
Il ya plus d'une décennie, les cellules souches embryonnaires humaines (HuESCs) ont été obtenues à partir de blastocystes humains 1. Depuis lors, ces cellules ont fait l'objet d'un important domaine de recherche qui porte sur des questions non satisfaits en biologie du développement humain. HuESCs ont en outre fourni des espoirs en médecine régénérative. Au cours des dernières années, les cellules souches pluripotentes humaines induites (CISP) ont été générés à partir de cellules somatiques du patient spécifique, en fournissant des modèles de maladie génétique 2. Beaucoup dans les protocoles in vitro pour la différenciation des cellules souches pluripotentes embryonnaires ou induites vers différentes lignées cellulaires, y compris les lignées de coeur 3, ont été rapportés. Les cellules différenciées sont souvent phénotypées par analyse de l'ARN et l'expression de la protéine, une immunocoloration, et / ou dans des tests fonctionnels in vitro. Cependant, les dérivés pluripotent de cellules souches doivent être placées dans un environnement approprié embryonnaire afin de vérifier si elles acquièrent entièrement la cell sort de leurs homologues embryonnaires et si ils récapitulent la véritable fonction in vivo en réponse à des signaux régionaux. Alors que l'ingénierie tissulaire est prometteuse, elle ne fournit pas encore tous les repères connus et inconnus de la bonne in vivo développement des tissus embryonnaires 4,5.
étiquetage portable avec des colorants ou des vecteurs rétroviraux dans les embryons, y compris les embryons de souris, ont apporté des informations importantes sur l'origine embryonnaire des lignées de cellules au cours du développement cardiaque 6. Par exemple, la teinture injection dans l'espace péricardique d'embryons de souris ex vivo, suivie par la culture in vitro des coeurs isolés, a été utilisé pour marquer des cellules épicardiques et leurs descendants 7. Cependant, colorant et l'étiquetage des cellules rétroviral ont été principalement appliqué à des embryons de souris au début avec les organes encore peu développés, ou des embryons de poulet, qui sont plus facilement accessibles 8. Une exception est le cerveau, ce qui est plus facile à une cible dans l'embryos 9,10. Une telle approche n'a pas encore été appliquée au coeur de la souris embryonnaire battre.
Pour compléter l'étiquetage direct avec des colorants ou des virus et d'effectuer le suivi dans la lignée des embryons plus avancés de souris de scène et de souris adultes, l'approche de marquage des cellules a été associée à l'analyse de souris transgéniques à l'aide de la technologie Cre / Lox. L'approche Cre / Lox 11 dispose cependant quelques limitations dues à la spécificité spatio-temporelle des régions régulatrices génomiques utilisés pour diriger l'expression de la recombinase, et l'efficacité de la recombinaison Cre / Lox 12. En outre, cette approche ne répond pas pleinement aux questions spécifiques d'acquisition axée sur la migration des cellules du destin cellulaire, car il ne peut marquer un précurseur après activation de la région régulatrice utilisée pour conduire l'expression Cre. Il peut également ne s'applique pas aux embryons humains à des questions éthiques évidentes.
Compte tenu de ces limitations, nous avons conçu une série de nouveaux protocoles pour injecter une variété d'agents de marquage de cellules tels que des colorants fluorescents, des virus, des modulateurs de l'expression génique tels que des shRNA et des vecteurs d'étiquetage de la cellule à base d'ADN, ou des cellules dans l'embryon de souris à E9.5 et des stades ultérieurs de développement dans les régions ciblées de l' cœur.
Les injections d'ADN / cellulaires utilisent une loupe binoculaire et un dispositif de micro-injection simple combinée avec la culture ex vivo embryon jusqu'à 48 h, ou le cœur isolé ou de la culture des explants embryonnaires pendant 48-72 h. Nous présentons également un protocole de micro-injection ultrasons médiation dans les coeurs de souris embryonnaires in utero. Cette technique permet de suivre l'évolution des embryons 13 et permet à long terme de suivi des injectates et / ou des cellules marquées.
Nous avons constaté que ces approches préservent la fonction de l'organe et fournissent un environnement plus représentatif de l'essai in vitro du potentiel des cellules souches. Il offre également la possibilité de suivre la migrationde marqué et / ou injecté des cellules de contrôler leur destin. En fin de compte, ce qui devrait donner une meilleure compréhension de la structuration du tissu régional et processus biologiques essentiels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les ex vivo protocoles d'injection intra-cardiaques décrits ci-dessus sont conçus pour préserver la fonction myocardique pendant au moins 48 heures à la mi-étape (E9.5-E11.5) des embryons de souris. Ces approches permettent d'injection pour l'injection dans l'espace ciblée de l'ADN ou des cellules. Les quelques exemples présentés dans les figures 1-3 fournissent une preuve de concept pour délimiter ex vivo et in vivo des mécanismes moléculaires des proces…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent la Fondation Leducq (MITRALE) et l'Agence Nationale pour la Recherche (ANR Specistem) pour financer cette recherche.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Altro | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
Riferimenti
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
