תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי
Summary
אנו מתארים סדרה של שיטות להזריק צבעים, וקטורי DNA, וירוסים, ותאים במטרה לעקוב אחר שני גורל התא והפנוטיפ של תאי אנדוגני והמורכבים שמקורם בתאים עובריים או pluripotent בעוברי עכברים ביום עוברי (E) 9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח.
Abstract
בדיקת גורלם של תאי גזע עובריים או נגזרי pluripotent במבחנת פרוטוקולים הובילה לתוצאות שנויות במחלוקת, שאינו משקפים בהכרח in vivo את הפוטנציאל שלהם. רצוי, צריכים להיות ממוקמים בתאים אלה בסביבה עוברית תקינה על מנת לרכוש פנוטיפ מובהק שלהם. יתר על כן, שושלת תא התחקות מחקרים בעכבר לאחר סימון תאים עם צבעים או וקטורי רטרווירלי נשארה מוגבלת בעיקר לעוברי עכברים בשלב מוקדם עם איברים עדיין מפותחים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, עיצבנו פרוטוקולי microinjection סטנדרטיים ותיווך אולטרסאונד כדי להזריק סוכנים שונים באזורים הממוקדים של הלב בעוברי עכברים בE9.5 ושלבים מאוחרים יותר של התפתחות. explant או עוברים עובריים בתרבית ואז או שמאלה כדי לפתח עוד יותר ברחם. סוכנים אלה כוללים צבעי ניאון, וירוס, shRNAs, או תאי גזע ובתאים שמקורם בתא. הגישות שלנו מאפשרות לשימור של פוnction של האיבר תוך מעקב הגירה וגורלם של תאים שכותרתו ו / או בזריקה. ניתן להאריך בטכנולוגיות אלה לאיברים אחרים ויהיה מועיל מאוד כדי לענות על שאלות ביולוגיות מרכזיות בביולוגיה של התפתחות.
Introduction
לפני יותר מעשור, בתאי גזע עובריים אנושיים (HuESCs) כבר נגזרו מבלסטוציטים אנושי 1. מאז, תאים אלה הפכו את הנושא של תחום חשוב של מחקר המתייחס לשאלות שלא סופקו בביולוגיה התפתחותית אנושית. HuESCs לי יתר סיפק תקוות ברפואת רגנרטיבית. בשנים האחרונות, תאים אנושיים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) כבר נוצרו מהתאים סומטיים מטופל ספציפי, המספקים מודלים של מחלה גנטית 2. רבים בפרוטוקולי מבחנה להתמיינות של תאי גזע pluripotent עובריים או מושרה כלפי שושלות תאים שונות, כוללים שושלות לב 3, כבר דיווח. התאים מובחנים לעתים קרובות phenotyped על ידי ניתוח של RNA וביטוי חלבון, immunostaining, ו / או בבדיקות תפקודיות מבחנה. עם זאת, נגזרים בתאי גזע pluripotent צריך להיות ממוקם בסביבה עוברית תקינה על מנת לבדוק אם הם רוכשים את cel מלאגורל ליטר של עמיתו העוברי שלהם ובין אם הם לשחזר את התפקוד vivo באמיתי בתגובה לאותות אזוריות. בעוד הנדסת רקמות היא מבטיח, זה עדיין לא מספק את כל הרמזים ידועים ובלתי ידועים של הראוי in vivo מתפתחים רקמה עוברית 4,5.
תא תיוג עם צבעים או וקטורי רטרווירלי בעוברים, לרבות עוברי עכברים, הביא מידע חשוב באשר למקור העוברי של שושלות תאים במהלך התפתחות לב 6. לדוגמא, לצבוע הזרקה אל תוך חלל קרום הלב של עוברי עכברי vivo לשעבר, ואחריו תרבות במבחנה של לבבות בודדים, שימש לתווית תאי epicardial וצאצאיהם 7. עם זאת, צבע ותיוג תא רטרווירלי כבר מיושמים בעיקר לעוברי עכברים מוקדמים עם איברים עדיין מפותחים, או עוברי עופות, שהם יותר נגישים בקלות 8. יוצא מן הכלל הוא במוח, שהוא קל יותר למקד בדוארmbryos 9,10. גישה כזו טרם יושמה אל לב העכבר העוברי הפועם.
כדי להשלים את התיוג ישיר עם צבעים או וירוס ולבצע שושלת התחקות בעוברי שלב מתקדמים יותר בעכבר ועכברים בוגרים, גישת תיוג תא כבר בשילוב עם ניתוח של עכברים הטרנסגניים באמצעות טכנולוגית Cre / לקס. גישת Cre / קס 11 עם זאת תכונות מסוימות מגבלות עקב הספציפיות spatiotemporal של אזורי רגולציה גנומית להשתמש בכונן ביטוי של recombinase, ואת היעילות של רקומבינציה Cre / קס 12. יתר על כן, גישה זו אינה מתייחסת באופן מלא על השאלות הספציפיות של רכישה מונעת נדידת תאים של גורל תא כפי שהוא יכול רק לתייג מבשר לאחר ההפעלה של אזור הרגולציה להשתמש בכונן ביטוי Cre. כמו כן, לא ניתן להחיל על עוברים אנושיים לסוגיות אתיות ברורות.
בהתחשב במגבלות אלה, עיצבנו סדרה של p החדשrotocols להזרים מגוון של סוכני תיוג תא כגון צבעי ניאון, וירוס, מאפנני ביטוי גנים כגון shRNAs ווקטורי תיוג תא מבוסס ה-DNA, או בתאים בעובר של העכבר בE9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח באזורים ממוקדים של לב.
זריקות ה-DNA / התא להשתמש סטראו ומכשיר microinjection פשוט בשילוב עם vivo לשעבר תרבות עובר עד 48 שעה, או לב מבודד או תרבות explant עוברית ל48-72 שעה. גם אנו מדווחים פרוטוקול microinjection תיווך אולטרסאונד בלב העוברי של עכברים ברחם. טכניקה זו מאפשרת ניטור הפיתוח של עוברים 13 ומאפשרת מעקב ארוך טווח של injectates ו / או תאי שכותרתו.
מצאנו כי גישות אלו לשמר את התפקוד של האיברים ולספק סביבה ייצוגית יותר מאשר בדיקה במבחנה של פוטנציאל של תאי גזע. הוא גם מספק את ההזדמנות כדי לעקוב אחר נדידהכותרתו של ו / או הזריק תאים כדי לפקח על גורלם. סופו של דבר, זה אמור להניב הבנה טובה יותר של דפוסים רקמה אזוריים ותהליכים ביולוגיים מרכזיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
לשעבר פרוטוקולי ההזרקה תוך לב vivo שתוארו לעיל נועדו לשמור על תפקוד שריר הלב לפחות 48 שעות באמצע הבמה עוברים (E9.5-E11.5) עכבר. הזרקת גישות אלה מאפשרים להזרקה ממוקדת במרחב של ה-DNA או תאים. כמה דוגמאות שמוצגים איורים 1-3 לספק הוכחה של קונספט להתוויית vivo לשעב?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים הקרן Leducq (מיטרלי) וNationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר (מענק ANR Specistem) למימון מחקר זה.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Altro | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
Riferimenti
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
